Artículo General

  • Fecundación in vitro en bovinos: Avances en el manejo de gamentos
DOI: 10.5354/0716-260X.1994.6142

Resumen

En el último tiempo se ha logrado un importante progreso en las tecnologías de fecundación in vitro en el ganado bovino; sin embargo, a pesar de haber obtenido gestaciones a partir de estas técnicas, es baja aún la tasa de desarrollo de los ovocitos madurados y fecundados in vitro, por lo que es importante seguir progresando en esta área. Este artículo resume varios aspectos en relación a la capacitación espermática y reacción acrosómica, como también la maduración y fecundación in vitro de ovocitos en bovinos. Se aportan antecedentes para optimizar el manejo y la fecundación de los gametos, y también la aplicación potencial de estos procedimientos en la producción animal y en la investigación.

Palabras clave: Bovinos, ovocitos, espermatozoides, fecundación in vitro.

Abstract

Remarkable progress has recently been made in vitro fertilization technology in cattle; althogh pregnancies have resulted from this techniques, the rate of development from  in vitro inaturated oocytes is still very low; further progress must to be made. This report summarizes various aspects of in vitro sperm capacitation, acrosome reaction and maduration and fertilization of oocytes in bovines. Important factors to success of in vitro garretes management, fertilization as well as applications of these procedures to the animal producción and research are adressed.

Key words: Bovines, oocytes, spermatozoa, in vitro fertilization.

 

Abstract

En el último tiempo se ha logrado un importante progreso en las tecnologías de fecundación in vitro en el ganado bovino; sin embargo, a pesar de haber obtenido gestaciones a partir de estas técnicas, es baja aún la tasa de desarrollo de los ovocitos madurados y fecundados in vitro, por lo que es importante seguir progresando en esta área. Este artículo resume varios aspectos en relación a la capacitación espermática y reacción acrosómica, como también la maduración y fecundación in vitro de ovocitos en bovinos. Se aportan antecedentes para optimizar el manejo y la fecundación de los gametos, y también la aplicación potencial de estos procedimientos en la producción animal y en la investigación.

Palabras clave: Bovinos, ovocitos, espermatozoides, fecundación in vitro.

Abstract

Remarkable progress has recently been made in vitro fertilization technology in cattle; althogh pregnancies have resulted from this techniques, the rate of development from  in vitro inaturated oocytes is still very low; further progress must to be made. This report summarizes various aspects of in vitro sperm capacitation, acrosome reaction and maduration and fertilization of oocytes in bovines. Important factors to success of in vitro garretes management, fertilization as well as applications of these procedures to the animal producción and research are adressed.

Key words: Bovines, oocytes, spermatozoa, in vitro fertilization.

 

Introducción

La manipulación in vitro de gametos y embriones ha adquirido una gran importancia en los últimos años siendo los bovinos, dentro de los animales domésticos, los que representan el mayor interés para desarrollar estas tecnologías emergentes de fecundación, tendientes a la producción de embriones.

La producción de embriones in vitro representa una excelente opción en las estrategias de mejoramiento reproductivo y genético en el ganado bovino, incluyendo además el incrementar la disponibilidad de producto animal para el consumo humano, superar problemas de infertilidad en vacas de alto valor comercial y aumentar la eficiencia reproductiva de los animales.

Por otra parte, es importante enfatizar que las técnicas de fecundación in vitro por sí mismas son un interesante objeto de investigación, llegando a ser una importante vía para estudiar los eventos celulares y moleculares involucrados en la interacción gamética, como así también en la fecundación y desarrollo embrionario temprano. De hecho, actualmente la contribución más significativa de estas tecnologías ha sido la disponibilidad de cigotos y embriones tempranos para el estudio de los procesos básicos de la reproducción en los animales.

Desde los primeros estudios en esta área, ha existido un enorme progreso en las técnicas de fecundación in vitro. En los países desarrollados, el nacimiento de terneros debido a estas tecnologías (Xu y col., 1987), prueba que estos métodos pueden conducir a resultados viables y satisfactorios, lo que abre una gran perspectiva a países en desarrollo como el nuestro, no obstante represente un desafío el poder desarrollar adecuadamente estas nuevas tecnologías.

Componentes importantes en los estudios de fecundación in vitro son las técnicas de manipulación previa de los gametos: maduración de ovocitos, capacitación espermática y reacción acrosómica, considerando en ambos casos la variabilidad biológica de los gametos.

 Proyecto DTI A 3139-923F.

Maduración de ovocitos

La maduración nuclear y citoplasmática ocurre in vivo durante el crecimiento folicular y la ovulación. Este desarrollo ovocitario va de la mano con la maduración folicular, siendo ambos procesos inducidos por cambios característicos en los niveles plasmáticos de las gonadotrofinas. La relación entre el ovocito y las células foliculares se modifica durante el período de maduración como resultado de cambios en la membrana del ovocito y el sistema señales intercelulares (Thiboult, 1977; 1988; Moor, 1990); además se modula la sensibilidad del ovocito a los inhibidores de la maduración como son el AMPc y purinas (Sirard y First, 1988; Downs, 1993).

La maduración extra nuclear involucra alteración en la organización de los organelos citoplasmáticos, en la membrana celular y en la matriz vitelina (Downs, 1990; 1993). La maduración del núcleo se caracteriza por estados alternados de desarrollo y de arresto de la meiosis. La primera interrupción en la progresión meiótica es la prolongada etapa de dic. ateno, quedando el núcleo en un estado de desarrollo llamado vesícula germinativa, que sirve en forina práctica para identificar los ovocitos inmaduros. Durante su crecimiento, el ovocito adquiere la capacidad de reiniciar la maduración meiótica en respuesta al estímulo gonadotrófico preovulatorio, específicamente el alza de LH; de ese modo se rompe la envoltura nuclear, se elimina el primer corpúsculo polar y se continúa la meiosis hasta metafase dos (Figura 1), etapa en la cual el ovocito queda arrestado por segunda vez y de esa forma es ovulado. Este desarrollo de metafase 1 a metafase 2 se conoce como el período de 'maduración ovocitaria'. El segundo arresto en metafase dos se mantiene hasta que el ovocito sea fecundado o activado partenogénicamente, completándose la meiosis con la consiguiente eliminación del segundo corpúsculo polar.

 

Figura 1. Ovocitos bovinos madurados ira vitro con medio de cultivo 199 suplementado. Observación con microscopía de contraste de fase. a: Eliminación del primer corpúsculo polar b: Inmaduro. (De los Reyes, 1992)

El aporte de ovocitos disponibles a través de tratamientos hormonales para lograr superovulación es limitado, especialmente por el alto costo que ello implica; es por esto que los ovocitos madurados in vivo han sido superados por los madurados in vitro. Los ovarios de vacas sacrificadas en matadero proporcionan una adecuada y abundante fuente de ovocitos a bajo costo, los cuales son susceptibles de madurar y fecundar in vitro. Sin embargo, al considerar el valor genético de la vaca, la aspiración de folículos antrales in vivo guiado por medio de ultrasonografía (Pieterse y col., 1988), se presenta como una técnica promisoria que hay que considerar.

Los sistemas de maduración in vitro deben asegurar que el ovocito resultante complete normalmente la primera división reduccional y sea capaz de ser fecundado dando origen a un cigoto competente que logre continuar su desarrollo luego de la transferencia. Leibfried y col. (1989) lo resumen a tres aspectos principales en la maduración de los ovocitos que deben ser considerados durante su cultivo: maduración nuclear, capacidad de ser fecundados y capacidad de continuar su desarrollo.

Sin embargo, el potencial de desarrollo en cultivo ha sido pobre, sólo un porcentaje pequeño de los ovocitos usados para la maduración y fecundación in vitro han podido llegar a ser embriones transferibles. Esta modesta tasa de éxito se debe en parte a que las condiciones apropiadas que conduzcan al desarrollo in vitro no son bien conocidas.

Existen diversas técnicas para obtener ovocitos desde los ovarios de matadero; entre éstas está la disección individual de los folículos (Sato y col., 1990), corte y fragmentación de ovarios (Takagi y col., 1992; Hamano y Kuwayama, 1993), punción y aspiración de folículos antrales (Leibfried y First, 1979, Lu y Gordon, 1988; Parrish y col. 1988; Kim y col. 1990; Bavister y col. 1992, De los Reyes, 1992; Brackett y Zuelke, 1993). Este último método, debido a su rapidez, ha sido el más difundido por los diversos investigadores y tiene un rendimiento aproximado de 10-20 ovocitos por ovario.

Los ovocitos se obtienen generalmente de folículos antrales mayores a 2 mm y menores a 6-7 mm de diámetro ya que ovocitos de folículos más pequeños carecerían de competencia meiótica en cultivo (Motlik y Fulka, 1986), vale decir, serían incapaces de completar la maduración nuclear. Ya que la capacidad para madurar de los ovocitos está restringida al final del período de crecimiento, los ovocitos en etapas muy tempranas son incapaces de experimentar la ruptura de la vesícula germinativa después de su aislamiento de las células de la granulosa. Por otra parte, ovocitos de folículos más grandes a menudo se encuentran en procesos de atresia; es por ello, probablemente, que los mayores porcentajes de fecundación y desarrollo se obtengan con ovocitos de folículos entre 2-7 mm como lo demuestran los trabajos de Pavlok y col. (1992).

La selección correcta de los ovocitos para madurar en el laboratorio es crucial para el éxito en el desarrollo y posterior producción de embriones. En la vaca el porcentaje de ovocitos que alcanzan la maduración pareciera ser igual que en otras especies, donde existiría una relación con el tamaño inicial del gameto; así, la ruptura de la vesícula germinativa se ha observado en ovocitos con diámetros sobre 91µm; la eliminación del primer polocito con diámetros sobre 101µm y los porcentajes mayores de maduraciones incompletas en ovocitos con diámetros menores a 120µm (Motlik y Fulka, 1986; Sato y col., 1990). Sin embargo, una buena selección de los ovocitos a madurar in mitro se basa normalmente en escoger aquellos con el citoplasma homogéneo no granular ni polarizado y con células del cúmulo intactas rodeando al gameto, ya que ellos representan los mayores porcentajes de maduración (Leibfried y col., 1989; De Loos y col., 1989, De los Reyes y col., 1994).

La remoción de todas las células de la corona y del cúmulo previo a la incubación, se relaciona a una posterior disminución del reinicio meiótico (Sirard y First, 1988); esto se debe a que los ovocitos denudados de las células del cúmulo son incapaces de responder a la LH y FSH, ya que estas células son las mediadoras del efecto de las gonadotrofinas (Ball y col., 1983; Muller y Behrman, 1986; Brackett y col., 1989; Zuelke y Brackett, 1990; Sirard y col., 1992).

Por otra parte, muchos cultivos mejoran su capacidad de maduración in mitro cuando se les adiciona 'células colaboradoras' como las células de la granulosa; concentraciones bajas (1 a 5 x 106/ml) de células de la granulosa estimulan la maduración nuclear (Sirard y col., 1992), aunque inicialmente retarden el reinicio meiótico. Con este sistema se estaría imitando las interrelaciones celulares que ocurren en el folículo in vivo. También, por otro lado, se ha demostrado el efecto positivo de la adición de factores del crecimiento epidermal (EGF) en los medios de maduración ovocitaria (Park y Lin, 1993).

Las condiciones de cultivo durante la maduración in vitro juegan un papel crucial en las tasas de fecundación y en la adquisición de la capacidad de desarrollo posterior de los embriones. Existe una gran cantidad de estudios que intentan mejorar el ambiente de cultivo tendientes a imitar los eventos finales de la ovogénesis que ocurren durante el período periovulatorio en los folículos dominantes.

Tradicionalmente se han usado para madurar ovocitos bovinos, medios complejos tamponados y suplementados con albúmina, sueros y/u hormonas (FSH, LH y 17(3-estradiol); no obstante, los ovocitos bovinos reinician la meiosis en una gran variedad de medios que van desde una solución salina simple (Leibfried y col., 1989), hasta medios más complejos; sin embargo, se prefiere estos últimos ya que se ha comprobado que el medio utilizado afecta no solamente la capacidad posterior de fecundación, sino que también el desarrollo embrionario (Schvellander y col., 1990; Bavister y col., 1992; Shanisuddin y col., 1993).

Dentro de estos medios, el que se ha utilizado más ampliamente es el medio 199 (TCM199), debido a que con éste se han obtenido, en comparación a otros medios, mejores porcentajes de maduración y desarrollo posterior in vitro (Bavister y col., 1992; Rose y Bavister, 1992) (Figura 2).

 

Figura 2. Capacidad de desarrollo de embriones derivados de ovocitos madurados en diferentes medios de cultivos. (Bavister, y col., 1992)

La suplementación del medio con gonadotrofinas y estradiol ha probado tener un favorable efecto, especialmente en lo que se refiere al desarrollo post maduración (Xu y col., 1986; Younis y col., 1989). Las gonadotrofinas provocan un aumento significativo en la cantidad de AMPc en las células de la granulosa e inducen la maduración ovocitaria; aunque este efecto parece contradictorio a la acción inhibitoria del AMPc (Sirard y First, 1988; Downs, 1990), se ha sugerido un efecto dual de este nueleótido en la regulación de la maduración ovocitaria. De acuerdo a esto, sus niveles basales mantendrían el arresto de la meiosis, mientras que niveles elevados y transitorios de AMPe mediarían la acción de las gonadotrofinas para inducir el reinicio meiótico (Sanbuissho y col., 1992). La LH mejora las condiciones de maduración in vitro, modificando el ambiente nutricional ya que aumenta la energía disponible para el ovocito; este efecto metabólico se debería al incremento de la glicólisis mediante la oxidación de la glucosa mitocondrial (Zuelke y Brackett, 1992). La LH además, impide los efectos inhibitorios que actúan sobre el gameto, logrando de ese modo la ruptura de la vesícula germinal (Downs, 1993).

La FSH, por otra parte, induce in vitro la expansión de las células de cúmulo en bovinos, a través de la síntesis de piruvato y ácido hialurónico (Ball y col., 1983, 1984). Esta mucificación sería dependiente, sin embargo, de la adición de suero fetal bovino al medio (Fenton y col., 1993). Se ha sugerido además que la FSH y el estradiol participarían en el bloqueo a la poliespermía durante la fecundación, a través de la síntesis previa de los gránulos corticales (Karlach, 1987).

La adición de esteroides no afectaría la maduración nuclear in vitro (Ball y col., 1984), ni la penetración espermática posterior de los ovocitos bovinos (De los Reyes y Barros, 1993), lo que puede indicar que la maduración no sería mediada a través de los esteroides; no obstante, ovocitos madurados sin estradiol disminuirían su capacidad de segmentarse normalmente y lograr un desarrollo posterior (Sirotkin, 1992).

El tiempo de incubación como también la temperatura, son parámetros importantes a considerar en los protocolos de maduración ovocitaria. La temperatura utilizada más comúnmente en los cultivos de células mamíferas es 37°C. En los cultivos de gametos bovinos, en cambio, se ha utilizado rutinariamente 39°C, por ser ésta la temperatura corporal de la especie y por haber probado mejorar significativamente los porcentajes de fecundación in vitro, en comparación a otras temperaturas (Lenz y col., 1983); no obstante, para la maduración nuclear al menos, no habría diferencias importantes en los cultivos a 39°C y 37°C, ya que los ovocitos reinician la meiosis alcanzando la metafase dos, cuando son madurados a 37°C o 39°C (Leibfried y col., 1986). Sin embargo, posteriormente las diferencias serían manifiestas al comparar los porcentajes de fecundación de los ovocitos madurados con ambas temperaturas (Lenz y col., 1983).

La duración óptima del tiempo de maduración ha sido también sujeto de estudio; normalmente se ha estandarizado a un período de 22-26 horas debido a que en ese lapso se lograría completar satisfactoriamente la maduración hasta metafase dos (Cuadro 1), obteniéndose, además, mayores tasas de segmentación posterior y menor desarrollo parteno génico (Xu y col., 1986; Lim y col., 1992); no obstante, hay autores que señalan que no existirían diferencias notables al disminuir este tiempo a 18 horas (Prokojiev y col., 1992); por otra parte, ovocitos cultivados por 44 a 48 horas para maduración aún podrían mantener su capacidad de transformar el núcleo espermático en pronúcleo, pero disminuiría su capacidad de segmentación posterior (Chian y col., 1992).

CUADRO 1 CAMBIO DEL ESTADO NUCLEAR DE OVOCITOS BOVINOS DURANTE 24 DE MADURACIÓN IN VITRO

Horas (a)

N° de ovocitos

N° (%)

GV

GVBD

MI

Al

TI

Mil

0

31

29(93,5)

2(6,5)

-

-

-

-

3

30

22(73,3)

8(26,7)

-

-

-

-

6

33

11(33,3)

19(57,6)

3( 9,1)

-

-

-

9

37

1( 2,7)

25(67,6)

11(29,7)

-

-

-

12

34

2( 5,9)

17(50,0)

14(41,2)

1(2,9)

-

-

15

31

-

4(12,9)

12(38,7)

6(19,4)

9(29,0)

-

18

26

-

1(3,8)

9(34,6)

5(19,2)

10(38,6)

1(3,8)

21

27

-

3(11,1)

-

3(11,1)

3(11,1)

18(66,7)

24

26

-

2(7,7)

-

-

-

24(92,3)

a: Tiempo de fijacion después del inicio del cultivo para maduración (Lim y col., 1992)

Capacitación espermática

En los sistemas de fecundación in vitro es de vital importancia tener protocolos y metodologías adecuados para la preparación de los espermatozoides. Naturalmente la capacitación espermática ocurre en el tracto genital femenino, lo que fue descrito originalmente por Austin (1951) y Chang (1951); durante este proceso de capacitación el gameto sufre una serie de fenómenos que lo conducen a la hiperactivación y reacción acrosómica (Barros y col., 1967; Barros y Berríos, 1977; Fraser, 1992), procesos considerados vitales para la penetración espermática a la zona pelúcida y para la posterior fusión del espermatozoide con la membrana plasmática del ovocito.

Cambios en la permeabilidad de la membrana plasmática al calcio gatillarían una señal de inicio a la reacción acrosómica. El aumento de este ión intracelularmente induce, entre otras respuestas, el aumento del AMPc (Uguz y col., 1992) y la activación de las fosfolipasas (A2,C) asociadas a la membrana. Así durante la reacción acrosómica hay una fusión y vesiculación de la membrana plasmática y membrana acrosómica externa, con la consiguiente exocitosis del contenido acrosomal (Barros y col., 1967; Langlais y Robert, 1985; Fraser, 1990). Fisiológicamente, las cubiertas ovocitarias estarían involucradas en este fenómeno, ya que se ha comprobado que proteínas de la zona pelúcida serían agonistas espermáticas inductoras de estos procesos (Florman y First, 1988; Knopt, 1990; Wassarman, 1992).

Los primeros trabajos exitosos sobre fecundación in vitro, en bovinos, se lograron utilizando espermatozoides capacitados in vivo (Iritani y Niwa, 1977, Hanada y Nagase, 1981), lo que ha sido actualmente reemplazado ampliamente por los sistemas de capacitación in vitro, tanto con espermatozoides epididimarios, eyaculados o criopreservados. Sin embargo, a pesar que el semen criopreservado tiene menor tiempo de sobrevida en cultivo en relación a los espermatozoides eyaculados u obtenidos del epidídimo, es de mayor utilidad trabajar con las muestras congeladas y descongeladas ya que por una parte está su fácil utilización en el momento adecuado, como también la conveniencia de obtener herencia paterna específica y selección de los reproductores.

Para lograr la capacitación y reacción acrosómica in vitro de los espermatozoides bovinos, se han utilizado variadas metodologías y protocolos de tratamiento espermático (Cuadro 2). La separación celular previa mediante 'swim up', hace que se recuperen los espermatozoides con mejor motilidad y la posterior incubación de éstos con heparina, según lo propuesto originalmente por Parrish y col. (1985; 1986), ha proporcionado altos porcentajes de fecundación in vitro, lo que ha hecho que este protocolo se haya estandarizado en muchos laboratorios. Otra alternativa de separación espermática es el gradiente de percol (Utsumi y col., 1991), que es equivalente a un 'swim down', ya que se recuperan del fondo del tubo los espermatozoides más motiles.

CUADRO 2 MÉTODOS UTILIZADOS PARA CAPACITAR IN VITRO ESPERMATOZOIDES CRIOPRESERVADOS DE TORO

Autor

Método

Tiempo de incubación

Bousquet y Brackett (1982)

Alta fuerza iónica (380mOsm/kg)

5 minutos

Hanada (1985), Bird y col. (1989)

Ionóforo de Calcio A 23187

1 minuto

Graham y col. (1987); Eaglesome y Müller (1989)

Liposomas

7 minutos

Niwa y col. (1988)

Cafeína

2-3 horas

Parrish y col. (1986); (1988) Florman y First (1988); De los Reyes (1992)

Heparina

4 horas

Park y col. (1989)

Heparina y cafeína

1 hora

In vitro, la heparina ha demostrado ser el glicosaminoglicano más potente en inducir la reacción acrosómica en espermatozoides de toro (Parrish y col., 1986); esta inducción se caracteriza por ser indirecta, promoviendo la captación del calcio por los espermatozoides a través de los canales iónicos (Parrish y col., 1988). Por otro lado, la inducción de heparina es inhibida por la glucosa en el medio (5mM) (Parrish y col., 1985; Florman y First, 1988), siendo este efecto inhibitorio revertido por la adición de cafeína (First y Parrish, 1987), donde esta última sustancia además potenciaría la acción de la heparina (Park y col., 1989).

Se ha podido demostrar que la capacitación espermática inducida por heparina, depende de la dosis empleada en el medio capacitador, lo que incide posteriormente en las tasas de fecundación in vitro. Dosis de heparina entre 10 y 100 µg/ml, incrementan significativamente dichos porcentajes (Lu y Gordon, 1988). Directamente relacionado está el tiempo de incubación de los espermatozoides; empleando dosis entre 10-20 µg/ml de heparina, se necesitarían 4 horas para lograr los mejores resultados (Parrish y col., 1986; 1988; Florman y Firts, 1988; De los Reyes, 1992). Coincidentemente este período de incubación para lograr capacitación espermática, ha demostrado ser el tiempo donde existiría la mayor presencia de acrosina en la superficie del espermatozoide, lo que se ha determinado mediante el uso de anticuerpos monoclonales antiacrosina bovina (De los Reyes y Pérez 1991; De los Reyes y col., 1993). Esta enzima se activa durante la reacción acrosómica y su presencia se ha asociado con la penetración espermática a la zona pelúcida (Barros y col., 1992).

Otro factor importante que afecta la capacitación y por ende la fecundación in vitro, es la variabilidad individual entre los toros. Existen marcadas diferencias entre el semen de diferentes toros, como también del mismo animal para responder a los tratamientos in vitro. Estas diferencias se manifiestan tanto en la frecuencia como en las tasas de penetración espermática (Leibfried y col., 1989; Shi y col., 1990). Incluso se han descrito variaciones de más de 20% en las tasas de fecundación entre diferentes partidas de semen provenientes de un mismo toro (Otoi y col., 1993)

Fecundación

La fecundación es la culminación de una serie de eventos previos que involucran complejos mecanismos de reconocimiento celular e interacción gamética. Las evidencias sugieren que esta interacción se establece a través de un sistema de receptores complementarios que serían claves en el reconocimiento corno también en la unión de los gametos (Jedliki y Barros, 1985).

En la superficie de la zona pelúcida se han identificado proteínas ligantes que permitirían este reconocimiento (Wassarman, 1992); por otra parte, se ha establecido que los espermatozoides tienen receptores que unirían los ligandos de la zona, los cuales serían característicos para cada especie (Jones, 1990).

De una adecuada maduración nuclear y citoplasmática de los ovocitos bovinos, como también una eficiente capacitación de los espermatozoides, dependerá en gran medida el éxito de esta interacción gamética in vitro, tendiente a la fecundación. Es importante, además, considerar las condiciones empleadas en el medio de coincubación como son la temperatura y tiempo de coincubación.

La fecundación in vitro se realiza en gotas de 50-100 µl de medio Tyrode tamponado (pH 7,8) y modificado según los distintos laboratorios, utilizando una proporción de 10-15 ovocitos intactos o previamente denudados de las células del cúmulo, ya que ello podría favorecer la penetración espermática (Hawk y col., 1992), con una dosis aproximada de 1 millón de espermatozoides por ml de medio. In vivo, aunque se depositen millones de espermatozoides en el genital femenino, los ovocitos se enfrentan a muy pocos de ellos en el momento de la fecundación; de hecho, en hamster se ha determinado una relación cercana a 1 (Cumming y Yenagimachi, 1982). Sin embargo, en los sistemas artificiales, se coincuban los gametos con una densidad espermática alta para reforzar la posibilidad de fecundación; pero al no existir esta eficiente selección natural previa que reduce significativamente el número de espermatozoides al momento del encuentro y reconocimiento celular, los ovocitos se enfrentan por tanto a un alto número de espermatozoides, lo que, puede derivar en problemas de poliespermia ya que, además, los ovocitos madurados in vitro no desarrollan en forma tan eficiente el bloqueo a la poliespermia como los ovocitos madurados in vivo (Leibfried y col., 1986).

Simular en mejor forma las condiciones naturales durante la fecundación in vitro, incluye también mantener una atmósfera de CO2 (5%) y una temperatura adecuada (39°C), durante el período de coincubación de los gametos que es de aproximadamente 20 horas. Los espermatozoides bovinos criopreservados comienzan a penetrar los ovocitos a las 3 horas de iniciada la inseminación in vitro (Park y col., 1989), continuando este proceso de penetración hasta 24 horas después de la inseminación (Chian y col., 1992; De los Reyes, 1992).

CUADRO 3 EFICIENCIA DE LA FIV UTILIZANDO OVOCITOS DE VACAS DE MATADERO Y ESPERMATOZOIDES CRIOPRESERVADOS DE TORO

Autor

% Maduración de Ovocitos*

% de Fecundación **

Leibfried y col. (1986)

81

73

Xu y col. (1987)

67

70

Schvellander y col. (1990)

78

75

Kim y col. (1990)

63

55

Utsumi y col. (1991)

91

63

De los Reyes (1992)

67

57

*Ovocitos en metafase 11. **Penetración espermática o descondensación nuclear.

Conclusión

A pesar de los avances logrados en el estudio y manejo in vitro de los gametos bovinos, quedan muchos aspectos por investigar y resolver para tener una adecuada capacitación y reacción acrosómica de los espermatozoides, como también especialmente, lograr en forma eficiente la maduración nuclear y citoplasmática de los ovocitos en cultivo, ya que es aquí donde se presentarían los mayores problemas para obtener un adecuado desarrollo embrionario. No obstante, el manejo de los gametos en el laboratorio para la fecundación in vitro es sólo la primera etapa en la aplicación efectiva de nuevas tecnologías tendientes a la producción de embriones. Desafíos importantes son también el cultivo y la preservación de los embriones; así, una mayor utilización de embriones producidos en el laboratorio requiere, sin duda, su criopreservación donde la sobrevida embrionaria se vería favorecida con los nuevos procedimientos de vitrificación. Por otra parte, también está la necesidad obvia de mejorar las técnicas de transferencia a las hembras receptoras, al punto en el cual sea eventualmente posible transferir embriones producidos in vitro de la misma forma en que se realiza la inseminación artificial.

Lograr obtener embriones bovinos en el laboratorio pareciera tener un potencial considerable y la capacidad comercial de estas tecnologías en los años venideros puede llegar a ser muy significativa tanto para la investigación en reproducción como para la producción pecuaria.

Referencias

AUSTIN, C.R. 1951. Observation on the penetration of the sperm into the mammalian egg. Austr. J.Se. B4:581-596

BALL, G., M.L. LEIBFRIED, R.W. LENA, R.L. Ax, B.D. BAVISTER, N.L. FIRST, (1983) Factors affecting successul in vitro fertilization of bovine follicular oocytes. Biol. Reprod. 28:717-725.

 BALL, G.D., LEIBFRIED, M.L., Ax, R.L., FIRST, N.L. (1984). Symposium: embryo development and manipulation. J. Dairy Se. 67:2775-2785.

BARROS, C., BEDFORD, J.M., FRANKLIN, L.E. AL!STIN, C.R. (1967). Membrane vesiculation as a feature of the mammalian acrosome reaction. J. Cell Biol. 34:C1-C5.

BARROS, C. & BERRIOS, M. (1977). Is the activaded spermatozoa really capacited? J. Exp. Zool. 201:65-72.

BARROS, C., CAPOTE, C., PÉREZ, C., CROSBY, J., BECKER, M., DEIOANNES, A. (1992). Immunodetection of acrosin during the acrosome reaction of hamster, guinea pig and human spermatozoa. Biol. Res. 25:31-40.

BAVISTER, B.D., ROSE-HELLEKANT, T.A., PINYOPUMMINTR (1992). Development of in vitro matured/ira Otro fertilized bovine embryos into morulae and blastocyts in defined culture media. Theriogenology 37:127-160.

BIRD, J.M CAREY, S., HOUGHTON, J.A. (1989). Motility and acrosomal changes in ionophore-treated bovine spermatozoa and their relationship with in vitro penetration of zona free hamster oocytes. Theriogenology 32:227-242.

BOUSQUET, D., BRACKETT, B.G., DRESSEL, M.A., ALLEN, C.H. (1982). Efforts to correlate laboratory with field observation on bull sperm fertility. Theriogenology 20:601-613.

BOUSQUET, D., BRACKETT, B. (1982). Penetration of zona free hamster ova as a test to assess fertilizing ability of bull sperm after frozen storage. Theriogenology 17:199-213.

BRACKETT, B.G., COFONE, M.A., Bolct:, M.L., BOUSQUETT, D. (1982). Use of zonafree hamsters ova to assess sperm fertilizing ability of bull and stallion. Garrete Res. 5:217-227.

BRACKETT, B.G., YOUNIS, A.I., FAYRER-HOSKEN, R.A. (1989). Enhanced viability after in vitro fertilization of bovine oocytes matured ira vitro with high concentration of LH. Fertil. Stexil. 52:319-324.

BRACKETT, B., ZUELKE, K. (1993). Analysis of factors involved in the in vitro production of bovine embryos. Thexiogenology. 39:43-64.

CHANG, M. (1951). Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature 168:697-698.

CHIAN, R.C., NAKAHARA, H., NIWA, K., FUNAHSHI, M. (1992). Fertilization and early cleavage ira vitro of ageing bovine oocytes after Inaduration in culture. Theriogenology 37:665-672.

CUMMIN, J.M., YANAGIMACHI, R. (1982). Sperm egg ratios and the cite of thc acrosoma reaction during and vivo fertilization in the hamster. Gamete Res. 5:239-256.

DE LOOS, F., VAN ULIET, C., VAN MAURIK, P., KRUIP, T. (1989). Morphology of inmature bovine oocytes. Garrete Res. 24:197-204.

DE LOS REYES, M.I., PÉREZ, C. (1991) Inmunocalización de acrosina durante la capacitación de espermatozoides de toro. Arch. Biol. Med. Exp. 24:147.

DE LOS REYES, M.I. (1992). Estudio de la cinética de la liberación de acrosina en espermatozoides de toro durante la capacitacion, reacción acrosómica y penetración de la zona pelúcida. Tesis Magister Fac. Medicina. U. de Chile.

DE LOS REYES, M.I, BARROS, C. (1993). Interacciones gaméticas en bovinos: rol de la acrosina. Ciencia e Investigación Agraria 20:88-89.

DE LOS REYES, M.I., VALDIVIA, M., BARROS, C. (1993). Reacción acrosómica en espermatozoides de toro y conejo: estudio comparativo de presencia de acrosina. Simposio Internacional de Reproducción Animal. Córdoba. Argentina. Octubre.

DE LOS REYES, M., AGUAYO, J.P., BERLAND, M., BARRÍA, N., BARROS, C. (1994). Maduración in vitro de ovocitos de bovino. XIV Congr. Panamericano de Ciencias Vet. 989. Acapulco, México. Octubre.

DOWNS, S. (1990). The maintenance of meiotic arrest in mammalian oocytes. En fertilization in mammals. Serono Symposya, U.S.A. Bavister, B.D.Cummins, J. & Roldan, E.R. (eds) pp. 5-16.

DOWNS, S.M. (1993) Factor affecting the resumption of meiotic maturation in mammalian oocytes. Theriogenology 39:65-79.

EAGLESONIE, M.D., MILLER, S.A. (1989). Prediction of fertility of bovine semen: preliminary studies with the hamster egg penetration test. Theriogenology 31:643-651.

FENTON, S.E., DENTINE, M.R., Ax, R.L. (1993). Modulation of bovine oocyte-cumulus cell complex maduration and fertilization in vitro by glicosaminoglycans. J. Dairy Sc. 76:701-712.

FIRST, N.L., PARRISH, J.I. (1987). In vitro fertilization of Ruminants. J. Reprod. Fert. Suppl. 34:151-165.

FLORMAN, H.M., FIRST, N. (1988). The regulation of acrosomal exocytosis. 1 Sperm capacitation is required for the induction of acrosome reactions by the bovine zona pellucida in vitro. Dev. Biol. 128:453-463.

FRASER, L.R. (1990). Sperm capacitation and its modulation en: Fertilization in mammals. Serono Symposia, U.S.A. Bavister, B.D: Cummins, J. & Roldan, E.R. (eds), pp. 41-153.

FRASER, L.R. (1992). Requirements for successful mammalian sperm capacitation and fertilization. Arch. Pathol. Sab. Med. 116:345-350.

HAWK, H.W., NEL, N.D., WATERNtAN, R.A., WALL, R. (1992). Investigacion of means to improve rates of fertilization in vitro matured in vitro fertilized bovine oocytes. Theriogenology 38:989-998.

GRAHAM, J.K., FOOT, R.H., PARRISH, J.J. (1987). Effect of dilaurilphosphatidilcholine on the acrosome reaction and subsequent penetration of bull spermatozoa into zona-free hamster egg. Biol. Reprod. 35:413-424.

HAMANO, S., KUWAYAMA , M. (1993). in vitro fertilization and development of bovine oocytes recovered from the ovaries of individual donors: a comparison between the cutting and aspiration. Theriogenology 39:703-712.

HANADA, A., NAGASE, H. (1981). Effects sperm preincubation in rabbit uterus and of imidazole on the penetration of zona-free hamster eggs by bull and board spermatozoa in vitro. J. Anim. Reprod. 25:113-118.

HANADA, A. (1985). In vitro fertilization in cattle with particular referente to sperm capacitation by, ionophoro A23187. J. Anim. Reprod. 31:56-61.

IRITANI, A., NIWA, K. (1977). Capacitation of bull espermatozoa and fertilización in vitro of cattle follicular oocytes matured in culture. J. Reprod. Fert. 50:119-121.

JEDLICKI, A., BARROS, C. (1985). Scanning electron microscope study of in vitro penetration garrete interactions. Gamete Res. 11:121-131.

JONES, R. (1990). Identification and functions of mammalian spertn egg recognition moleculas during fertilization. J. Reprod. Fertil. Suppl. 42:89-105.

KARLACH, V. (1987). The effect of FSH, LH, 17(β E2, and progesterone on cytoplasmic maturation of bovine follicular oocytes in vitro. Folia Bol. 33:258-265.

KIM, C.I., ELLINGTON, J.E., FOOTE, R.H. (1990). Maturation, fertilization and development of bovine oocytes in vitro, using TCM 199 and a simple defined medium with co-culture. Theriogenology 33:433-440.

KNOP, G.S. (1990). The zona pellucida-Induced acrosome reaction: A model for spertn signal transduction. En: Fertilization in mammals. Serono Symposia, U.S.A. Bavister, B.D., Cummins, J. Roldan, E.R. (eds), pp. 253-266.

LANGLAIS, J., ROBERTS, K. (1985). A molecular membrane model of sperm capacitation and the acrosome reaction of mammalian spermatozoa. Gamete Res. 21:183-224.

LEIBFRIED, L., FIRST, L. (1979). Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro. J. Anim. Se. 48:76-83.

LEIBFRIED, M.L., CRITSER, E.S., FIRST, N.L. (1986). Effects of fetal calf serum and bovine serum albumin on in vitro maturation and fertilization of bovine and hamster cumulus oocyte complexes. Biol. Reprod. 35:850-857.

LEIBFRIED, L., CRTTSER, E.S., PARRISH, J.J., FIRST, N.L. (1989). In vitro maturation and fertilization of bovine oocytes. Theriogenology, 31:61-74.

LENZ, R.W., BALL, G.D., LEIBFRIED, M.L., Ax, R.L., FIRST, L. (1983). It vitro maturation and fertilization of bovine oocytes are temperature dependent processes. Biol. Reprod. 29:173179.

LIM, J.M., FUKUI, Y., OHO, H. (1992).Developmental competence of bovine oocytes frozen at various maturation stages followed by in vitro maturation and fertilization. Theriogenology 37:351-361.

LU, K.L., GORDON,I. (1988). Effect of heparin on the capacitation of frozen-thawed bovine spermatozoa used in the in vitro fertilization (IVF) of oocytes matured in vitro 11th. International Congress on Animal Reproduccion and I.A. Dublin, Ireland 26:30-339.

MILLER, J., BEHRNIAN, H. (1986). Oocyte maturation is inhibited by adenosine in the presente of FSH. Biol. Reprod. 35:833-837.

MOOR, R.M. (1990). Oocyte maturation. En: Fertilization in mammals. Serono Symposia, U.S.A. Bavister, B.J. Cummins, J. & Roldan, E.R. (eds) pp. 1-4.

MOTLIK, J., FuLKA, J. (1986). Factors affecting meiotic competence in pi- oocytes. Theriogenology 25:87-96.

NIWA, K., OHGODA, O. (1988). Synergistic effect of caffeine and heparinon in vitro fertilization of cattle oocytes matured in culture. Theriogenology 30:733-741.

OTOI, T., TACHKAWA, S., KONDO, S., SUAKI, T. (1993). Effects of different lots of semen from the lame bu¡] on in vitro development of bovine oocytes fertilized in vitro. Theriogenology 39:713-718.

PARK, K., OHGODA, O., NIWA, K. (1989). Penetration of bovine follicular oocytes by frozen-thawed spermatozoa in the presence of caffeine and heparin. J. Reprod. Fert. 86:577-582.

 PARK, Y.S., LIN, Y.C. (1993). Effect of epidermal growth factor (EGP) and defined simple media on in vitro bovine oocyte maturation and early embryonic development. Theriogenology 39:477-484.

PARRISH, J.J., SUSKO-PARRISH, J.L., FIRST, N. (1985). Effect of heparin and condroitin sulfate on the acrosome reaction and fertility, of bovine Sperm in vitro. Theriogenology 24:537-549.

PARRISH, J.J., SUSKO-PARRISH, J.L., LEIBFRIED-RUTLEDGE, L., CRITSER, E.S., EYESTONE, W.H., FIRST, N.L. (1986) Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen. Theriogenology, 25:591-600.

PARRISH, J.J., SUSKO-PARRISH, J.L., WINER, A., FIRST, N.L. (1988). Capacitation of bovine sperm by heparin. Biol. Reprod. 38:1171-1180.

PAVLOK, A., LUCAS-HAHN, A., NIENIAN, H. (1992). Fertilization and developmental competente of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Mol. Reprod. Dev. 31:61-67.

PIETERSE, M.C., TAVERNE, M.A., KRUIP, T.A. (1988). Collection of bovine oocytes by means of a transvaginal ultrasound guided puncture technique. 11 th. International Congresss on Animal Reproduction and I.A. Dublin Ireland 30:348-350.

PROKOKIEV, M.I., ERNST, L.K., SURAEVA, N.M., LA GUTINA, I.S., UDAVLENNIKOVA, N.N., KESYAN, A.Z., DOLGOGATSKIY, A.I. (1992). Bovine oocyte maturation, fertilization and further development in vitro and after transfer into recipients. Theriogenology 38:461-469.

ROSE, T.A., BAVISTER, B.D. (1992). Effect of oocyte maturation medium on in vitro development of bovine embryos. Mol. Reprod. Dev. 31:72-77.

SANBUISSHO, A., COSKUN, S., LIN, Y. (1992). Rol of CAMP in vitro on bovine maturation Theriogenology 38:153-163.

SATO, E., KAWAMURA, N., ISHIBASHI, T. (1988). Chemicals influencing maturation, activation and degeneration of bovine oocytes in culture. J. Dairy Se. 71:3482-3488.

SATO, E., MATSUO, M., MIYAJIOTO, H. (1990). Meiotic maturation of bovine oocytes in vitro: improvement of meiotic competence by dibutiryl cyclic adenosive 3', 5' monophosphate. J. Anim. Se. 68:1182-1197.

SCFIVELLANDER, K., FUHRER, F., BRACKETT, B.G., KORB, H., SCHELEGER, W. (1990). In vitro fertilization and cleavage of bovine oocytes matured in medium supplemented with estrous cow serum. Theriogenology 33:477-485.

SHANISUDDIN, M., LARSSON, B., RODRÍGUEZ, H. (1993). Maturation related changes in bovine oocytes under different culture conditions. Animal Reprod. Se. 31:49-60.

SHI, D.S., Lu, K.H., GORDON, J. (1990). Effect of bull on fertilization of bovine oocytes and there subsequent development in vitro. Theriogenology. 33:324.

SIRARD, M.A., FIRST, N.L. (1988). In vitro inhibition of oocyte nuclear maturation in the bovine. Biol. Reprod. 39: 229-234.

SIRAD, M.A., COENNE, K., BILODEAU, S. (1992). Effect of fresh or cultured follicular fractions on meiotic resumption in bovine oocytes. Theriogenology 37:39-57.

SIROTKIN, A.V. (1992). Involvement of steroid hormones in bovine oocytes maturation in vitro. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 41:855-858.

TAKAGI, Y., MORI, K., TAKAHASHI, T., SUGAWARA, S.A., MASAKI, J. (1992). Differences in development of bovine oocytes recovered by aspiration or by mincing. J. Anim. Se. 70:1923-1927.

THIBAULT, C. (1977). Are follicular maturation and oocyte maturation independent processes? J. Reprod. Fert. 51:1-15.

UGUZ, C., SUSKO-PARRISH, J.L., PARRISH, J.J. (1992). Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is elevated during capacitation of bovine sperm by heparin or oviduct fluid. Theriogenology 37:311.

UTSUMI, K., KATO, H., IRITANIM, A. (1991). Fullterm development of bovine follicular oocytes natured in culture and fertilized in vitro. Theriogenology 35:695-703.

WASSARMAN, P.M. (1988). The mammalian ovum. En: The Physiology of Reproduction. E. Knobil & Neil, J. (eds). Raven Press, New York, pp. 69-102.

WASSARMAN, P.M. (1992). Mouse gamete adhesion molecules. Biol. Reprod. 46:186-191.

XU, P. K., GREVE, T., SMITH, S., HITTEL, P. (1986). Chronological changes of bovine follicular oocyte maturation. Acta Vet. Scand 27:505-519.

XU, R.P., GREVE, T., CALLESEN, H., HITTEL, P. (1987). Pregnancy resulting from cattle oocytes matured and fertilized in vitro. J. Reprod. Fertil. 81:501-504.

YOUNIS, A.J., BRACKETT, B.G., FAYRER, R.A. (1989). Influence of serum and hormones of bovine oocyte maturation and fertilization in vitro. Gamete Res. 23:189-201.

ZUELKE, K.A., BRACKETT, B.G. (1990). Luteinizing hormone enhanced in vitro development of in vitro fertilized bovine embryos. Mol. Reprod. Develop. 31:72-77.