Introducción

Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) produce un síndrome entérico en terneros en el cual los serotipos aislados más reiteradamente en los animales son: 08, 09, 020, 0 101 (Tzipori, 1985) además de 026, y de 0 141 (Acres, 1985). En nuestro medio estos serotipos, con excepción del serotipo 09, no han sido aislados. (Zurita y col., 1990).

El rol que juegan los antígenos somáticos y capsulares de ciertas cepas no es del todo conocido, pero está comprobado entre otros por Acres (1985) que cepas K99+ poseen una mayor capacidad colonizadora. Mainil y col. (1990) sostienen que cepas E. Coli responsables de diarrea en terneros, producen enterotoxinas termo estables (STaP), que no contribuyen a la inmunidad. Además, se ha establecido que la STaP estimula a nivel de membrana del enterocito la guanilato ciclasa con un incremento del GMPc intracelular (Dove y col., 1987), que se traducen en un bloqueo del mecanismo absortivo de agua, de cloruros y un incremento de la hipersecreción (Tzipori, 1985).

El cuadro clínico producido por E. Coli, es variable, dependiendo de la patogenicidad de la cepa, factores ambientales y la inmunidad alcanzada. La diarrea que se establece presenta heces isotónicos, ricas en electrolitos y de un pH alcalino, observándose a la necropsia enteritis catarral, que en ocasiones se presenta hemorrágica, acompañada de hiperemia en diversos órganos y sistemas, no detectándose grandes variaciones hemáticas (Chantal y col., 1985).

Este trabajo analiza las variaciones de algunos componentes hemáticos en animales que cursan una enteritis inducida por una cepa de campo, tipificada, de E. coli enterotoxigénica.

 

Financiado por proyecto FONDECYT N° 0787-89.

Materiales y métodos

Se seleccionaron 19 terneros Holstein Friesian, de lecherías de la Región Metropolitana que contaban con asesoría profesional permanente, normas de manejo y sanitarias adecuadas.

Los animales seleccionados, recién nacidos, se presentaron normales al examen clínico. En todos ellos se exigió la condición de un parto normal, se controló además la ingesta o no de calostro según correspondiera.

Los animales fueron asignados, aleatoriamente, en tres grupos, en los cuales se desarrollaron las siguientes actividades.

Grupo

N° Animales

Consumo Calostro

Inóculo**

Tratamiento***

I

4

SI*

NO

NO

II

10

NO

SI

SI

III

5

NO

SI

NO

* 'Ad libitum', grupo de referencia. ** Escherichia Coli K99+ Dosis (100 ml de 6 x IO8 U.F.C./ml). Vía oral. *** Gentamlclna (4-5 mg-/kg) e/12 Hrs. En cinco animales se inició a la Hora (1 h.), V en los otros cinco animalesa las 6 Hrs. posteriores a la presentación de diarrea, manteniéndolo en ambos grupos Hasta 48 Hrs. Posteriores al término de diarrea. Se seleccionó este antibiótico en base aun antlblogranla previo a la inoculación. Además, se administró suero poliiónico y, suero glucosa al 5% de acuerdo al grado de deshidratación.

El inóculo se preparó de acuerdo a lo descrito por Priels y col. (1989) con algunas modificaciones, a partir de una cepa de campo de Escherichia coli K99+, ST+, previamente tipificada (Smith y col., 1990). A los animales de los grupos ll y lll el inóculo les fue administrado vía oral a la 39,6 ± 16,5 y a las 41 ± 16,6 hrs. de vida respectivamente.

De cada animal se obtuvo sangre por punción yugular antes y posterior al inóculo cada 8 a 12 hrs. por un período de 48 hrs., para luego controlarlos semanalmente durante el primer mes de vida.

En la muestra con EDTA[1 se determinó Hemoglobina (Hb), por el método colorimétrico de la cianometahemoglobina, además del volumen globular aglomerado (VGA), recuento de eritrocitos en cámara Neubauer y se calcularon los índices hetriatimétricos de Wintrobe. Además se efectuó un recuento leucocitario total (Hemocitómetro) y en un frotis teñido con Giemsa se obtuvo la cuenta diferencial de leucocitos de acuerdo a la técnica descrita por Schalm (1986).

En las muestras sin anticoagulante se determinó los niveles de cloruros séricos (mmol/L) en un cloridrómetro Buchler. Además de sodio sérico (mmol/L) y potasio sérico (mmol/L) en un fotómetro de llama Perkin-Elmer, utilizado como diluyente Triton X-100.

La osmolaridad se determinó en un equipo Advance 3W2, en base al principio de descenso del punto de congelación de líquidos biológicos.

En todos los animales del grupo lll y en un 20% de los animales del grupo l se obtuvo una muestra para determinar bicarbonatos séricos en un analizador de gases Gillmore-Mcleod.

En todos los animales durante el ensayo se obtuvo muestras de heces mediante tórula estéril las que se sembraron en medios diferenciales para enterobacterias; luego a las cepas que por pruebas bioquímicas correspondían a E. coli se les determinó por aglutinación la presencia de K99+, utilizando suero de conejo anti K99+, (Smith y col., 1990).

Paralelo a ello se efectuó el diagnóstico de rotavirus en heces obtenidas por estímulo del reflejo anal, empleando anticuerpos monoclonales con una prueba de aglutinación comercial (Slidex Rota-Kit., 2R. (Bio-Merieux. Francia).

Para descartar Cryptosporidium, se obtuvo c/48 hrs. 3 muestras diarias en los animales con diarrea durante todo el período que ésta se presentó, y en las heces se aplicó la técnica de Henriksen y Pohlens (1982).

Los animales fueron alojados en ternereras individuales hasta los 30 días de vida, con comederos y bebederos individuales permaneciendo todos los animales bajo techo.

Los animales recibieron sustituto (Spray Fo BlueR) y la dieta fue concentrado comercial Huachito IR, alfalfa picada, con una incorporación de un 25%. Durante toda la experiencia los animales dispusieron de agua 'ad libitum'.

Por medio de un análisis de varianza y por la prueba de comparación múltiple de Scheffe (Snedecor y Cochran, 1990) se estableció el nivel de significancia de las diferencias intra e intergrupal. El V.G.A. fue corregido por la fórmula de Bliss previo a su análisis.

1 Ácido etilendiaminotetraacético. volver

Resultados

La diarrea se inició entre una a siete horas (4 ± 3,2 hrs) posterior al inóculo, con una duración que varió desde 6 a 22 horas, presentándose en 13 de 15 animales inoculados (86,7%).

Todos los animales del grupo sin tratamiento, (lll) murieron entre 9 a 16 hrs. post inoculación y un animal del grupo tratado (ll) lo hizo a los diez días (40%).

A la necropsia se observó una deshidratación con congestión en varios órganos, los túbulos renales y hepatocitos presentaron tumefacción turbia, los ganglios mesentéricos con actividad linfopoyética marcada. El íleon con necrosis epitelial, congestión a infiltración linfocitaria submucosa.

Desde las heces de los animales con diarrea y en dos terneros sin esta sintomatología fue posible recuperar la cepa de E. Coli K99+, la cual resultó positiva a la prueba de enterotoxigenicidad al inocularla en ratón lactante. No se detectó en ellas rotavirus ni Cryptosporidium y por las características histopatológicas se descartó la acción de otros virus (corona) o bacterias, como responsables del cuadro entérico.

Al hemograma la serie roja (Hb, VGA, N° de Eritrocitos/ul) no presentó variaciones estadísticamente significativas entre los tres grupos de animales, durante el desarrollo del estudio. No obstante ello, los grupos inoculados presentaron una tendencia al incremento en estos valores a las 24-72 hrs. post-inóculo, que luego se estabilizó en el grupo tratado (II). El grupo sin tratamiento (III) presentó un descenso progresivo (Figura 1).

Fig. 1. Hemoglobina de terneros inoculados con E. coli K99+.

La proteína plasmática total del grupo I (que ingirió calostro) presentó un nivel significativamente superior a los de los otros grupos de animales (p < 0,05). Luego del inóculo se presentaron variaciones en el grupo III tendiendo al aumento. El fibrinógeno se incrementó desde 0,47 g/dl a 1,45 g/dl (p < 0,05) en el grupo no tratado (III) P.I. (Figura 2).

Fig. 2. Fibrinógeno de terneros inoculados  con E. coli K99+. 

La cuenta total de leucocitos presentó variaciones no significativas (p > 0,05); sin embargo, se observó una tendencia contraria entre el grupo control no inoculado, que se incrementa y el tratado que tiende a disminuir luego del inóculo (11,6 hrs.) (p < 0,05). El grupo no tratado (III) no presentó una tendencia clara, observándose que los neutrófilos segmentados tienden a descender luego del inóculo con aparición de una desviación a la izquierda de leve a moderada. Los monocitos se incrementan y son significativamente diferentes (p < 0,05) que previo al inóculo y al de los animales no inoculados (I) y al de los inoculados tratados (grupo II). (Figura 3).

Fig. 3. Variaciones de leucocitos totales de terneros inoculados con E. coli K99+.

En relación a las variaciones de electrolitos (Figura 4), el sodio en los animales inoculados de niveles de 136,1 ± 7,2 mqE/L previo la inoculación desciende a 128,4 mEq/L a las 44 hrs. post inóculo en los animales tratados (II) y a 125,7 mEq/L a las 20 hrs. P.I. en los no tratados (III).

Fig. 4. Sodio, cloro y potasio de terneros inoculados con E. coli K 99+.

Los cloruros de un promedio de 90,3 ± 22,1 mEq/L en el control preinóculo descienden a 83,6 ± 17 mEq/L a las 8 hrs. P.I. en el grupo no tratado, que se acentuó a 76,2 ± 21,34 mEq/L a las 36 hrs. P.I.

El potasio de niveles medios de 4,9 ± 2,6 mEq/L previo al inóculo, presentó un incremento P.I en el grupo tratado llegando a 7,0 mEq/L a las 8 hrs. P.I. que se mantuvo hasta las 68 hrs. P.I. (7,0 mEq/L) para caer bruscamente a 3,3 mEq/L a las 30 hrs. P.I., para luego presentarse muy variable.

En relación a la osmolaridad (Figura 5) ella también se presentó muy variable observando niveles de 291 ± mOSmol/K el primer día de vida para luego incrementarse a 301 mOSmol/K al tercer día post inóculo en los animales tratados. El grupo no tratado presentó un incremento de 21 mOSmol/K a las 8 hrs. P.I. respecto de su nivel preinóculo.

 Fig. 5. Variaciones osmolaridad de terneros inoculados con E. coli K99+.

Las variaciones del bicarbonato sérico del grupo no tratado (III) que se iniciaron con niveles de 38,5% mmol/L al día de vida descendieron a 31,2; 30,5 y 29,5 mmol/L a las 8, 20, 32 hrs. P.I. a diferencia del grupo no inoculado (I) control que se mantuvo estable en el tiempo (40,1 ± 1,35 mmol/L) (Figura 6).

Fig. 6. Variaciones de bicarbonato sérico de terneros inoculados con E. coli K99+.

Discusión

La reproducción de un cuadro entérico, por E. coli enterotoxigénica está sujeta a grandes variaciones, por lo que previo a la ejecución de este trabajo fue necesario realizar numerosos ensayos, con el objeto de estandarizar dosis y protocolos de obtención de muestras, para lo cual se utilizaron distintas cepas de campo. Una vez logrado esto, se escogió aquella cepa que logró reproducir en forma constante la enfermedad. Las dosis utilizadas en los ensayos preliminares variaron de 1 x 109 hasta 6 x 1010 UFC.

En este estudio, el inóculo requirió de 18 hrs de incubación y posteriormente una resiembra e incubación por 4 horas; no obstante ello, la inoculación se realizó dentro del período de susceptibilidad del ternero a ETEC (Contreposis y Gouet, 1983; Acres, 1985, Tzipori, 1985).

La dosis de inoculación utilizada en el presente estudio fue semejante a las empleadas por varios autores, Massip y col. (1993), Bachman (1983), Chantal y col. (1985), Lacheretz y col. (1987), quienes utilizaron dosis entre 108 y 1011 UFC.

La diarrea se presentó dentro del período que Chantal y col. (1985) observaron, y fueron anteriores a lo descrito por Massip y col. (1983), (12 a 15 horas P.I.), y Priels y col. (1989), quienes observaron el cuadro a las 24 horas P.I.

En el grupo tratado, algunos terneros no presentaron diarrea y en ellos se logró aislar de sus heces E. coli K99+. Esto ha sido previamente descrito por Prieels y col. (1989) asumiendo que ello puede ser explicado por factores individuales de resistencia.

Las muertes ocurridas en el grupo sin tratamiento (entre las 9 y 16 horas P.I.), fueron generadas por la intensa deshidratación producto de una diarrea acuosa, produciendo la muerte por un shock hipovolémico y paro cardiorrespiratorio. Estos resultados son semejantes a los obtenidos por Chantal y col. (1985); Lacheretz y col. (1987), donde la muerte se produjo como promedio a las 25 horas P.I.

En relación al estudio hematológico, en el hemograma se observó que posterior a la inoculación, se presentó un leve incremento significativo de la hemoglobina y el VGA, lo cual se puede atribuir a la reducción del volumen plasmático producto de la deshidratación (Dalton y col, 1985). La alta variabilidad de estos parámetros entre individuos, en el presente trabajo, no permitió detectar deshidratación por esta vía, lo cual había sido descrito por Kasari y Neylor (1985).

Los trabajos realizados por Dalton y col. (1965); Goncalves y col. (1991), coinciden con este estudio, al señalar que las variables de la serie roja no presentan modificaciones de importancia.

Los niveles de proteína plasmática P.I., no evidenciaron diferencias significativas entre los grupos inoculados y referencia, lo cual coincide con los observado por Goncalves y col. (1991).

En el grupo tratado, la proteinemia se mantuvo con pequeñas variaciones hasta los 28 días de vida y sólo en el grupo no tratado se produjo un incremento de ésta a las 8 horas P.I.; éste es coincidente con el incremento del VGA y de la hemoglobina, y puede deberse a la manifiesta deshidratación, caracterizada por persistencia del pliegue cutáneo (2-4 segundos), yugular aplastada y los ojos hundidos.

El fibrinógeno en los grupos inoculados muestra valores sobre el valor normal, pudiendo atribuirse este aumento real a procesos inflamatorios o infecciones recidivantes que cursaron estos animales (abscesos, diarrea) o bien esta alza del fibrinógeno, puede explicarse por procesos infecciosos subclínicos (Schalm, 1986). Si se calcula la relación PS/F y se aplica el criterio de Schalm (1986), se puede descartar por esta vía, que el incremento del fibrinógeno sea producto exclusivo de la deshidratación.

La tendencia al alza observada en los linfocitos y al decenso en los neutrófilos observados en la cuenta diferencial de lucocitos en el grupo de referencia, es coincidente con lo descrito por Schalm (1986), el cual atribuye el mayor número de neutrófilos en los primeros días de vida, al alza de corticosteroides fetales, los cuales disminuyen posteriormente.

La disminución de los neutrófilos P.I., observada en todos los grupos puede ser atribuible a la marginación de éstos a los capilares, como respuesta normal a procesos infecciosos o a la escasa reserva que existe en la médula ósea y no tanto a la relación neutrófilo-linfocito (N/L), ya que en los primeros días de vida, ella es mayor o igual a 1. A partir de los días 4 ó 5 esta relación es menor a la unidad (Schalm, 1986).

Las grandes variaciones del leucograma en el grupo no tratado, con desviación a la izquierda regular, puede ser originada además por la inoculación y por las diarreas recidivantes a distintas patologías concomitantes (artritis, abscesos), que presentó el animal sobreviviente hasta los 28 días de vida.

En el plano bioquímico, la diarrea neonatal del ternero puede generar alteraciones metabólicas con desbalances electrolíticos (Kasari y Naylor, 1985; Hjerpe, 1990; Kasarl, 1990). En este trabajo los niveles de la natremia y kalemia se presentaron dentro de los rangos entregados por Dalton y col. (1985); López (1975); Kaneko (1980); Trembaly (1990). La cloremia se encontró en un nivel levemente inferior en todos los grupos.

Es importante señalar que las variaciones de los electro]itogramas en los grupos tratados fueron afectados por el ingreso de electrolitos por la vía de la rehidratación.

El sodio en este estudio (a excepción del grupo no tratado) es semejante al obtenido por Dalton y col. (1965), que entrega un promedio de 140 ± 5 mEq/L; y es inferior a lo obtenido por López (1975), cuyo valor fue de 154 ± 10 mEq/L.

La disminución de la natremia en los grupos inoculados se puede explicar por la pérdida de éste en las heces diarreicas como lo señalan Dalton y col. (1965), Massip y col. (1983), Fayet (1968), cit, por Zurita (1989), Naylor (1990), Tremblay (1990), Goncalves (1991).

El mayor valor de la kalemia en el grupo referencia no significativo, al primer muestreo, estaría dado por la ingesta de calostro, ya que él actúa como un factor solvente de las inmunoglobulinas, siendo este ión arrastrado desde el lumen intestinal. El posterior descenso de éste se debería a la probable acción kalitirética de la hormona antidiurética (López, 1975).

El incremento de la kalemia en los grupos inoculados puede ser explicado de acuerdo al cuadro clínico que en ese momento se presentaba, ya que la deshidratación genera acumulación de H+ producto de la acidosis, el cual ingresa a la célula y por consiguiente se produce liberación de potasio al extracelular. Además, éste puede verse incrementado por la menor excreción renal (Massip y col., 1983; Tremblay, 1990), ya que la deshidratación genera una menor tasa de filtración glomerular.

La disminución de la cloremia que se observó P.I., puede explicarse por la pérdida de este anión en las heces diarreicas según lo señala Massip y col. (1983); Lewis y Phillips (1968) cit por Zurita (1989); Naylor (1990) Tremblay (1990), el cual es eliminado en el proceso entérico al compartir el mecanismo del excreción del sodio.

En un estudio de diarrea del ternero realizado por Dalton y col. (196.5), los niveles de natremia, kalemia y cloremia no se afectaron significativamente; estos valores aumentaron o disminuyeron solamente en casos excepcionales. Tremblay (1990), también planteé) este hecho y lo atribuye a la pérdida de estos electrolitos en proporciones iguales con pérdidas de agua. Goncalves y col. (1991), señalan, que para que se genere una hiperkalemia el animal debe cursar una deshidratación severa y acidosis metabólica.

La osmolaridad (Figura 5) en todos los grupos previo al inóculo, se encuentra dentro de los valores entregados por López (1975); Tremblay (1990) (280-305 y 279-298 mOSmol/K respectivamente); sin embargo posterior a la inoculación, el grupo sin tratamiento mostró una clara tendencia al descenso hasta el sexto día de vida. Previo a la inoculación presentaban un valor similar a lo citado por López (1975).

El bicarbonato en el grupo sin tratamiento (Figura 6), presentó una disminución en forma marcada a las 8 horas P.l., atribuyéndose este efecto a la pérdida en las heces (Massip y col., 1983; Kasari 1990; Naylor, 1990; Tremblayy, 1990). Sin embargo, estas variaciones se mantuvieron dentro del rango normal (21-41 mEq/L) entregado por Kasari (1990). Sin perjuicio de lo anterior, a pesar que el bicarbonato se mantuvo dentro del rango normal para terneros, los de este grupo evidenciaron ciertas manifestaciones clínicas de acidosis metabólica, caracterizadas por disminución del reflejo de succión, menor respuesta táctil, extremidades frías y depresión. Posteriormente a los 21 días de vida en que el bicarbonato se encontraba en 38,5 mEq/L, se produce un descenso que alcanza un valor de 25 mEq/L; esto puede ser atribuido a las permanentes diarreas que se presentaron.

Aun cuando el número de terneros utilizados en esta experiencia no posibilita utilizar lo parámetros electrolíticos y la variación del hemograma como del bicarbonato, como valores de referencia del síndrome diarreico, éstos son importantes como un antecedente de lo que ocurre en este tipo de diarrea donde las tendencias que ellos presentaron fueron lo esperado.

El tipo de diarrea que genera ETEC, y el desequilibrio electrolítico observado, permiten sugerir como interesante de analizar el efecto de ciertos fármacos antisecretorios, sobre los cuales los antecedentes existentes son insuficientes, para explicar su comportamiento en esta patología.

Referencias

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