Introducción

La rinotraqueítis infecciosa bovina (RIB) es una enfermedad causada por un virus clasificado dentro de la familia Herpesviridae. Existen cinco tipos de virus herpes que poseen como hospedador natural al bovino, designados como Herpesvirus bovino (VHB) 1, 2, 3, 4 y 5 respectivamente. El VHB-1 se encuentra serológicamente relacionado con la RIB, vulvovaginitis pustular infecciosa (VPI), balanopostitis (BPI) y encefalomielitis no supurativa. También está relacionado con síntomas oculares, entéricos, neonatales y dermatitis infecciosas (Gibbs y Rweyemamu, 1977). La infección por VHB-1 se traduce en tres formas clínicas que pueden ocurrir simultá neamente o en forma aislada, siendo éstas: respiratoria, genital y abortigénica. En cualquiera de estos casos las pérdidas económicas son de gran impacto en la producción pecuaria.

La RIB es una enfermedad de distribución mundial, conocida en Estados Unidos de Norteamérica desde 1954. En Argentina fue diagnosticada por primera vez en 1968, aunque se la menciona desde 1959 (Bowes y col., 1970; Lager y col., 1981). El virus fue aislado por primera vez en el país en 1972 (Epstein y col., 1972). Estudios más recientes (Maliandi y col., 1996) indicaron que la infección con VHB-1 se detectó en el 97,68% de los establecimientos muestreados, siendo la prevalencia promedio en cada establecimiento de 45,5%. Aunque los estudios fueron regionales en la mayoría de los casos, todos demuestran la importancia de la enfermedad y su alta prevalencia (Di Santo y col., 1996; Fort y col., 1996).

La técnica de virus neutralización (VN) es desde hace años la prueba serológica de referencia para la detección de anticuerpos (AC) (Payment y col., 1979). La inmunofluorescencia es una alternativa confiable, rápida y relativamente más sensible que la VN (Payment y col., 1979; Assaf y col., 1975) aunque ofrece  dificultades técnicas y errores de interpretación ocasionados por la subjetividad del operador. El enzimo inmuno ensayo (ELISA) es utilizado en virología como reemplazante de la VN convencional, por ser de similar especificidad y sensibilidad superior y el ELISA indirecto (ELISA-I) ya es usado para el serodiagnóstico de diversos Herpes virus animales (Galos¡ y col., 1993; Hohdatsu y col., 1986; Dutta y col., 1983; Nosetto y col., 1992; Payment y col., 1979). El objetivo de este trabajo fue desarrollar una técnica alternativa a la VN para el diagnóstico serológico de la RIB, que fuera confiable, rápida y permitiera analizar una gran cantidad de muestras a un costo reducido.

Materiales y métodos

Células y, virus: se utilizó la línea celular RK 13 (riñón de conejo). Los cultivos celulares se desarrollaron con Medio Mínimo Esencial (MEM, Nissui, Japón) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), antibióticos y 0,3 mg/ml de glutamina (MC). Para la preparación de los Antígenos (Ag) se utilizó la cepa viral Los Angeles de BHV-1 [LA, Estados Unidos - 1956] (Gibbs y Rweyemamu, 1977), de título 105,75 DICT 50%/0,05 ml, obtenida a través del Vetermary Microbiology and Preventive Medicine, Iowa State University, Estados Unidos. El medio de mantenimiento celular fue el mismo que el anterior pero libre de SFB (MSS).

Antígeno soluble: monocapas celulares completas fueron inoculadas con multiplicidad de infección 0,5 e incubadas a 37°C con MSS. Cuando se observó efecto citopatogénico generalizado las células fueron recogidas junto con los sobrenadantes y centrifugadas a 8000 x g durante 20 minutos a 4°C (Centrífuga refrigerada Tomy Seijo RS-20). El 'pellet' se lavó dos veces con 'buffer' TE (Tris 0,01 M, EDTA 0,00I NI pH 7,4) y luego se resuspendió en el mismo 'buffer' con el agregado de 1 % de Nonidet P40 (NP40), en un volumen 200 veces menor al volumen de MSS sobrenadante original. Se centrifugó 15 minutos a 4000 x g y luego a 100.000 x g durante 60 minutos (Ultrace ntrífuga Beckman L8-80). El sobrenadante se utilizó como Ag viral (AgV), y se conservó a -20°C. Con la misma metodología se elaboró Ag control partiendo de células no infectadas (AgC).

Sueros: se utilizaron cuatro lotes de sueros: S1,) Cuatro sueros positivos de casos clínicos de VHB-1 y cuatro sueros negativos a VHB-1 previamente analizados por VN. Todos conservados en alícuotas a -80°C. S2) 587 muestras de sueros tomados al azar de rodeos bovinos. S3) Un suero positivo y un negativo de referencia a VHB-1 obtenidos a través del National lnstitute of Animal Health, Tsukuba, Japón. S4) Sueros heterólogos positivos a (VHS-1); VHE-1 y VHE-4. Todos los sueros fueron inactivados a 56°C durante 30 minutos.

VN: se desarrolló la técnica convencional en microplacas utilizando virus fijo-suero variable (Assaf y col., 1975).

ELISA-I: los Ag (AgV y AgC) fueron titulados diluyéndolos en buffer carbonato-bicarbonato 50 mM pH=9,6 y colocándose 0,1 ml de cada dilución a partir de la dilución 1: 15, en base dos, desde la columna 1 a la 12 en microplacas (Nunc Maxisorb), las cuales se incubaron toda la noche a 4°C en cámara húmeda, siendo posteriormente bloqueadas durante 60 minutos a 37°C con ovoalbúmina al 0,1 % o solución tamponada de fosfatos (PBS) con el agregado de Tween 20 al 0,005% (PBST) (IAEA, 1989). Esta última solución se utilizó también para el lavado y como diluyente de sueros y conjugado. Posteriormente y luego de tres lavados se agregaron los sueros del grupo S1, diluidos desde 1: 20, en base dos, desde la fila A hasta la H, y se incubaron a 37°C durante 60 minutos. Se lavaron tres veces y luego se incorporó a toda la placa 0,1 ml por pocillo de anti-gamaglobulina bovina conjugadas con peroxidasa (EY Laboratories, Estados Unidos) en la dilución 1:1000. Las placas se incubaron nuevamente durante 60 minutos a 37°C, se lavaron tres veces y por último se adicionó 0,1 ml por pocillo de solución de sustrato (ácido cítrico 0, 1 M; Fosfato disódico 0,2M; peróxido de hidrógeno al 0,01% y azinodietilbenzotiazol-sulfonato (ABTS) ─-Sigma─0,3 mg/ml). Los valores de densidad óptica (DO) obtenidos fueron leídos utilizando un filtro de 405 nm en un espectrofotómetro para microplacas (Titertek Multiskan Flow Laboratory, Reino Unido), a distintos intervalos de tiempo.

Para determinar el límite superior de negatividad se emplearon los sueros de los grupos S1 y S3, enfrentándolos a la dilución óptima de AgV y AgC. El límite superior de negatividad se estableció según los parámetros fijados por la Agencia Internacional de Energía Atómica (AIEA, 1989), considerándolos la DO promedio de muestras negativas por VN más un desvío estándar [DOXn + 1 DE]. Todos los sueros que enfrentados con el AgV tuvieron DO superior a los valores resultantes de la fórmula anteriormente citada fueron enfrentádos al AgC.

Para establecer el punto de corte se utilizaron los sueros de los grupos S2 y S3. La expresión del punto de corte se calculó por dos metodologías.

1. La DO promedio de la población negativa por VN y ELISA más un desvío estándar (DOXn + 1 DE).

2. El cociente (Cm) entre la diferencia de la DO de la muestra problema (DOm) y la DO promedio de las muestras control negativo (DOXc), y la diferencia entre los promedios de las DO de las muestras débil positivas (DOXdp) y la DO promedio de las muestras control negativo (DOXc) (Manual Herdecheck, 1986).

 Cm =

 Dom - (DO - Xc) ( DOXdp) - (DO -Xc)

Para el análisis de los resultados se utilizó el software S.A.S.® (Statistical Analysis System), siendo los procedimientos utilizados: el análisis de chi cuadrado, sensibilidad y especificidad, índice Kappa y el procedimiento GLM para el cual se utilizó un diseño experimental anidado.

Resultados y discusión

Se desarrolló un ELISA indirecto para detectar Acs contra VHB-1. La utilización de un Ag soluble preparado con células infectadas con virus resultó satisfactoria debido a que no fue necesaria la inactivación del virus, ya que con el uso de NP40 en el proceso de elaboración se destruyen los viriones (Hohdatsu y col., 1986).

El Ag reaccionó específicamente con los sueros positivos del grupo S1, determinándose una dilución óptima constante de uso de 1:1000, correspondiente a 4.4 ug de proteína por pocillo. La dilución 1: 64 de los sueros redujo el color de fondo inespecífico por lo cual se decidió utilizar esta dilución para todos los sueros problema.

No se observó reacción positiva, cruzada o inespecífica con el Ag enfrentado a los sueros del grupo S4. El uso de PBST como solución de bloqueo y diluyente de los sueros minimizó la inespecificidad de color, respecto al uso de ovoalbúmina en las mismas condiciones. El tiempo de lectura se estandarizó en 20 minutos y/o una DO de 1100 a 1300 del grupo S3. Todos los sueros del grupo S3, cuya DO fue superior a 725 con el AgV fueron posteriormente enfrentados al AgC.

Teniendo en cuenta el Cm se consideraron: negativo, Cm = < 1; débil positivo, Cm entre 1 y 1,3; y positivo franco Cm = ≥  a 1,4.

El análisis de ambos métodos estadísticos resultó significativo con p < 0.01 para chi cuadrado, valor del índice Kappa 0.872 (Martín y col., 1997) y p < 0.05 para GLM.

El análisis de los resultados utilizando la fórmula Cm, tuvo una interpretación más homogénea.

La sensibilidad de la técnica fue de 100% y la especificidad de 84,79%. (Tabla 1).

TABLA 1 RESULTADOS OBTENIDOS SOBRE 587 SUEROS DE CAMPO FRENTE AL VIRUS HERPESBOVINO-1 ANALIZADOS POR VIRUS NEUTRALIZACIÓN Y ELISA-1

-

VN+

VN-

Total

ELISA+

416(a)

26(b)

442

ELISA-

0(c)

145(d)

145

Total

416

171

587

Sensibilidad= a x 100/a+c = 100% Especificidad= d x 100/b+d= 84,79%

Nuestros resultados demuestran que este ELISA-I es específico para la detección de Ac contra VHB-1 y muy sensitivo para la detección de bajos niveles de Ac. Cuando la técnica fue aplicada a un gran número de muestras la alta sensibilidad se hizo evidente. Comparativamente con la VN el ELISA-I es menos costoso, consume menor tiempo y podría ser usado para titular rápidamente gran cantidad de sueros.

Referencias

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