Los estudios para obtener un antígeno adecuado, que sirva para descartar la respuesta inmunitaria humoral producida por la vacunación con Brucella abortus Cepa 19, logran éxito con Díaz y col. (1979), quienes describen el Poly B y que luego en 1981 simplifican su preparación obteniéndolo por doble precipitación con etanol. Cherwonogrodzky y Nielsen (1988) logran separar en estado casi puro el componente polisacárido de la pared brucelar o cadena 0 y luego Nielsen y col. (1989) lo utilizan en una prueba de enzimoinmunoensayo. La estructura polisacárida característica de este antígeno ha sido estudiada por Perry y col. (1986), llegándose en estudios recientes ha obtener preparados por precipitación etanólica que contienen hasta un 65% de polisacáridos (Lord y col., 1989).
En nuestro país, ya fue preparado un antígeno soluble extraído por precipitación etanólica, persiguiendo simplificar la metodología de extracción, con el fin de hacerlo accesible a un uso rutinario (Pinochet y col., 1989).
Ello ha hecho necesario estudiar la posibilidad de normalizar tanto la preparación del antígeno como la prueba de inmunodifusión en la que se utiliza.
En este estudio se pretende relacionar el contenido de hexosas totales del antígeno así preparado, con la capacidad precipitante de éste, por medio de una prueba de inmunodifusión doble, frente a sueros bovinos infectados de brucelosis y además, definir la concentración mínima con la que se obtiene una reacción de tipo funcional.
Igualmente, se pretende estudiar el comportamiento de este antígeno así normalizado ante sueros bovinos de diferentes características epidemiológicas en relación a brucelosis.
Financiado por proyectos FONDECYT 0439-88 y A-2940 DTI. Universidad de Chile. |
Preparación del antígeno: se obtuvo a partir de Brucella abortus Cepa 1119-3 basado en extracción salina en caliente y doble precipitación etanólica según el método descrito por Díaz y col. (1981), modificando la concentración de etanol en 4 y 2 volúmenes, en la primera y segunda precipitación, respectivamente. La centrifugación se realizó a 17.000 X g durante 30 minutos y el precipitado obtenido fue reconstituido a 1/3 de su volumen inicial (Pinochet y col., 1989).
Prueba de inmunodifusión doble (ID): se utilizó agarosa al 0,7% en un tampón TRIS-HCI 0,l M, pH 7,2, y un 10% de NaCI (Cherwonogroszky y Nielsen, 1988). Se empleó una roseta con pocillos de 3 mm de diámetro separados por 2 mm del pocillo central. La interpretación de resultados se hizo basado en lecturas a las 24, 48 y 72 horas y en la detección de una línea clara de precipitación (Pinochet y col. 1989).
Normalización del antígeno: se realizó una serie de diluciones dobles del antígeno preparado, con el fin de conocer la dilución óptima de trabajo, definida ésta como la dilución máxima que en la prueba de inmunodifusión produjo una línea de precipitación clara y única, dentro de 24 horas y que se mantenía sin modificaciones por más de 72 horas. Esta línea debía producirse únicamente al enfrentar el antígeno a sueros bovinos infectados naturalmente de brucelosis, comprobado esto por aislamiento bacteriológico de B. abortus patógena. Se excluía por metodología conocida la posible presencia de Cepa 19 (Alton y col. 1976).
Del mismo modo, esta línea de precipitación no debía producirse al enfrentar a sueros de bovinos negativos, procedentes de áreas libres de brucelosis de la XII Región del país.
La dilución óptima del antígeno fue analizada mediante la prueba de Anthrona. para determinar su contenido de hexosas (Hanson y Phillips, 1981). Como complemento se determinó la concentración de proteínas mediante el método de Bradford (1976).
Para comprobar si la capacidad de reacción del antígeno estaba relacionada con la concentración de hexosas, se prepararon tres nuevas partidas de antígeno y, por dilución o concentración, se igualó al contenido de hexosas del antígeno de dilución óptima. Por medio de la prueba de ID los antígenos nuevos fueron comparados en sus características de identidad inmunológica, tiempo de aparición de la línea de precipitación y su comportamiento frente a diluciones seriadas de sueros positivos a brucelosis.
El antígeno de dilución óptima, ya conocido su contenido de hexosas, constituyó el antígeno normalizado. Fue mantenido a -30°C en estado concentrado, debiendo diluirse antes de su uso.
Evaluación del antígeno: en una prueba de inmunodifusión doble se enfrentó el antígeno con 26 sueros de bovinos positivos por aislamiento, 72 negativos por origen provenientes de áreas de la XII Región, donde no se vacuna ni se ha detectado la enfermedad, y 150 bovinos vacunados con Cepa 19 (estas muestras fueron obtenidas 2 a 5 meses después de la vacunación). Se calculó la sensibilidad y especificidad de esta prueba de ID en base a los resultados de las muestras de bovinos positivos por aislamiento, y los negativos por origen.
Comparación de resultados con las pruebas de seroaglutinación estándar (SAE) y de Rosa de Bengala (RB): se utilizaron 254 sueros de hembras bovinas positivos a las pruebas ya citadas y realizadas según Alton y col. (1976), constatando que estas vacas no hubiesen recibido Cepa 19, sino sólo cuando terneras, y que tuviesen más de un parto; 265 sueros de bovinos jóvenes vacunados con Cepa 19, y positivos a una o a ambas pruebas, seleccionados de acuerdo a las fechas de vacunación del organismo oficial del Ministerio de Agricultura; 509 sueros de hembras negativas a las pruebas citadas. Los resultados fueron analizados por la prueba de McNemar y por estudios de sensibilidad y especificidad en base a las pruebas de SAE y RB.
Finalmente, se preparó un antígeno según la técnica descrita, regulando su concentración de hexosas, para verificar la repetibilidad del método.
La cantidad de antígeno obtenido por la cosecha de 12 botellas Roux fue de 106 ml, y se calcula que 1 ml, de antígeno alcanza para analizar 150 sueros aproximadamente, siempre que se utilice el esquema de roseta propuesto.
El preparado siempre produjo una sola línea de precipitación, claramente detectable a las 24 horas y cuyas características no se modificaban en las 48 horas siguientes. La dilución 1/2 del antígeno preparado según esta técnica apareció como la óptima y el contenido de hexosas de esta dilución fue de 115 μ/gml, constituyendo el antígeno normalizado. Esta dilución contenía además 86,4 μ/ml de proteínas.
Los resultados de los tres antígenos de prueba, cuyos contenidos de hexosas fueron equiparados con el del antígeno normalizado, fueron en todo iguales a los de este último, comprobándose igual identidad y capacidad de precipitación con diferentes diluciones de sueros, al ser enfrentados en la prueba de ID. No hubo precipitación o fue débilmente legible cuando se utilizó antígenos de menor concentración de hexosas.
Cuando se enfrentó el antígeno normalizado a sueros con antecedentes conocidos en relación a brucelosis, 24 de los 26 sueros de hembras con aislamiento de Brucella fueron reactores en la prueba de ID. Ninguno de los sueros negativos ni de los sueros negativos ni de los sueros de animales vacunados con Cepa 19 produjo línea de precipitación en la prueba. Según estos resultados, la sensibilidad fue de 92,3% y la especificidad de 100%.
En el cuadro 1 se presenta la relación de los resultados de la prueba de ID frente a los obtenidos en las pruebas de SAE y RB; igualmente, ninguno de los sueros procedentes de los bovinos vacunados (positivos a una o ambas pruebas de las usadas) reaccionó a la de ID. De los 254 sueros positivos a una o ambas pruebas, sólo el 5,5% no reaccionó a la prueba de ID. Frente a SAE no se produjeron cambios significativos según la prueba de McNemar, pero sí en el caso de RB (p 0,05).
CUADRO 1 RESULTADOS DE LA PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN (ID) EN SUEROS DE BOVINOS REACTORES Y NO REACTORES EN LAS PRUEBAS DE SEROAGLUTINACIÓN ESTÁNDAR (SAE) Y ROSA DE BENGALA (RB)
Grupos de bovinos |
-Nº |
SAE |
RB |
ID |
|||
Pos. |
Neg. |
Pos. |
Neg. |
Pos. |
Neg. |
||
Positivos |
254 |
234 |
19 |
234 |
0 |
240 |
14 |
Vacunados |
265 |
237 |
28 |
248 |
17 |
0 |
265 |
Negativos |
509 |
0 |
509 |
0 |
509 |
0 |
509 |
La sensibilidad y especificidad de la prueba de ID, usando SAE como base, fue de 94,5 y 100%, respectivamente, y en relación a RB, 94 y 100%, respectivamente, excluyendo en ambos cálculos a los animales vacunados.
El antígeno de prueba, preparado según la metodología descrita y normalizado a 115 μl/ml de hexosas, entregó en la prueba de ID una repetibilidad total de los resultados obtenidos por el antígeno en estudio.
El antígeno en estudio ha entregado los resultados esperados, demostrando un gran rendimiento, facilidad de preparación y manejo, bajo costo, etc.
Se trata de un antígeno poco purificado, en el cual es posible encontrar cierta cantidad de proteínas, las que alcanzaron a 86,4 μg/ml.
Trabajos anteriores han aclarado que los componentes del antígeno que participan en la reacción que genera la línea de precipitación, no corresponden a proteínas. En esta y en otras experiencias realizadas por los autores (Pinochet y col., 1989), no se ha comprobado la presencia de líneas agregadas de precipitación, claramente diferenciables por pruebas de identidad, sino sólo en tres oportunidades, sobre un total de más de 2.000 muestras.
La modificación en los volúmenes de etanol y la mayor fuerza centrífuga aplicada, permitieron obtener un precipitado más puro y más rico en hexosas y de menor tenor de proteínas, si se le compara con antígenos similares preparados anteriormente por nosotros (Pinochet y col., 1989).
La concentración de 155 μg/ml de hexosas fue aquella que permitió obtener una línea de precipitación adecuada, pues de hecho, concentraciones débilmente menores fueron incapaces de producir una reacción fácilmente identificable.
La estabilidad del antígeno mantenido a -30°C fue demostrada al menos durante 14 meses, sin que se modificara en forma aparente su reactividad. A pesar de ello se recomienda que este antígeno pudiera ser liofilizado, para asegurar su estabilidad.
Sin duda la característica más relevante de este antígeno es la de reaccionar sólo con los sueros de bovinos infectados naturalmente y no con aquellos vacunados, cualidad que ya ha sido comentada anteriormente.
El hecho que dos sueros de animales infectados comprobados por aislamiento bacteriano no reaccionaran en la prueba de ID, representa una menor sensibilidad del antígeno. Como antecedente complementario se puede agregar que estos sueros también fueron no reactores en la prueba de fijación de complemento; uno solo de ellos reaccionó a RB y ambos resultaron con títulos de 1:50 y 1:100, respectivamente, a la prueba de SAE.
Otros trabajos recientemente realizados también han encontrado una proporción similar de sueros de animales infectados que no reaccionan en la prueba de (Cherwonogrodzky y Nielsen, 1988).
La especificidad de la prueba, al igual que en trabajos anteriores, ha sido óptima. En relación a su comportamiento con antisueros contra bacterias que presentan alguna reacción cruzada con Brucella, ello ya ha sido demostrado anteriormente por nosotros (Pinochet y col., 1989).
Cuando se compararon los resultados de la prueba de ID con aquellos de SAE y RB, se comprobó una clara relación, con la excepción de los sueros de bovinos vacunados. Éstos no reaccionaron en la prueba de ID aunque presentaron claros títulos a la prueba de SAE y fueron positivos a la prueba de RB, lo que corrobora la bondad del método.
Se escogieron las pruebas de SAE y RB en la comparación, porque éstas son de uso rutinario y aunque pudieran merecer algunos reparos, los países en desarrollo como el nuestro las siguen usando con frecuencia.
Es necesario agregar que las muestras incluidas en la comparación provenían de 26 predios lecheros del centro y sur del país, con diferentes características epidemiológicas en relación a brucelosis.
La utilidad de la prueba de ID utilizando el antígeno normalizado, permite complementar el diagnóstico de brucelosis bovina tanto en las acciones de erradicación como de control. Los resultados que entregan encuestas tradicionales incluyen muchos bovinos reactores, cuyas respuestas obedecen sólo a persistencia de anticuerpos postvacunales. Por otro lado, varios países han incluido en sus planes de control en áreas de alta prevalencia de brucelosis, la vacunación de bovinos adultos con dosis reducidas de Cepa 19, lo que en muchas ocasiones también genera respuestas postvacunales de cierta duración (Pinochet y col., 1986).
Si bien la preparación del antígeno y su normalización es más o menos especializada, la prueba de ID, contando con el antígeno adecuado. puede realizarse en cualquier laboratorio de diagnóstico rutinario, sin necesidad de equipos ni personal especializado.
Agradecimientos
Se agradece la colaboración de la Dra. Consuelo Borie P., en la realización de algunos análisis químicos.
ALTON, G. G., L. M. JONES, D.E. PIETZ. 1976. Las técnicas de laboratorio en la brucelosis. 2° ED. Ginebra. Organización Mundial de la Salud. 175 p. (Serie Monográfica N° 55). |
BRADFORD, M. M. 1976. A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254. |
CHERWONOGRODZKY, J.W., K. H. NIELSEN. 1988. Brucella abortus 1119-3 0 chain polysaccharide to differentiate sera from B. abortus S19 vaccinated and field-strain-infected cattle by agar gel immunodiffusion. J. Clin. Microbiol. 26: 1120-1123. |
DÍAZ, R., P. GARATEA, L. M. JONES, U. MORIYON. 1979. Radial immunodiffusion test with a Brucella polysaccharide antigen for differentiating infected from vaccinated cattle. J. Clinical Microbiol. 10: 37-41. |
DIAZ, R., J. Toyos, M. D. SALVO, M.L. PARDO. 1981. A simple method for the extraction of polysaccharide B from Brucella cells for use in the radial immunodiffusion test for diagnosis of bovine brucellosis. Ann. Rech. Vét. 12: 35-39. |
HANSON, R.S., T.A. PHILLIPS. 1981. Chemical compositions. In: Gerhardt, P. Manual of methods for general bacteriology. Am. Soc. for Microbio¡, pp. 326-364. |
LORD, V.R., M.R. ROLO, J.W. CHERWONOGRODZKY. 1989. Evaluation of humoral immunity to Brucella sp. in cattle by use of an agar-gel immunodiffusion test containing a polysaccharide antigen. Am. J. Vet. Res. 50: 1813-1816. |
NIELSEN, K., J. W. CHERKONOGRODZKY, J. R. DUNCAN, D. R. BUNDLE. 1989. Enzyme linked immunoassay for differentiation of the antibody response of cattle naturally infected with Brucella abortus or vaccinated with strain 19. Am. J. Vet. Res. 50: 5-9. |
PERRY, M.B., D. R. BUNDLE, J.W. CHERWONOGRODZKY. 1986. The structures and serology of A and M antigens of Brucella abortus and Brucella melitensis and the structure of polysaccharide B of Brucella species. XIV Int. Congress of Microbiology. Manchester. Sept. |
PINOCHET, L., W. NIEMEYER, C. NEWMANN. 1986. Revacunación de bovinos gestantes con Brucella abortus Cepa 19 en dosis reducida. Av. Cs. Vet. 1: 17-22. |
PINOCHET, L., P. ÁBALOS, M.L. SÁNCHEZ, I. PALAVICINO, M.A. VENT. 1989. Preparación y evaluación de un antígeno para descartar respuesta postvacunal a Brucella abortus Cepa 19. Av. Cs. Vet. 4: 43-48. |
Recibido el 23 de mayo de 1990, aprobado el 24 de agosto de 1990. |