Contenido

En las áreas donde se vacuna contra la brucelosis del bovino, es de importancia diagnóstica poder diferenciar si la reacción positiva que se produce con determinada prueba, obedece a que el bovino está realmente infectado o bien que la reacción es debida a la presencia de anticuerpos residuales de la vacunación, específicamente con Cepa 19.

En los últimos años, con el fin de evitar estos errores de diagnóstico, se han producido antígenos solubles, los cuales no contienen los lipopolisacáridos que participan como antígenos en la mayoría de las pruebas de diagnóstico de brucelosis (Dubray, 1984). Estos diferentes componentes génicos se han obtenido mediante extracción salina, fenólica, por ácido tricloro– acético, por sonicación u otros métodos (Díaz y col., 1968; Shuring y col., 1978; Mc Mahon y col., 1980; Tabatabai y Deyoe, 1984; Díaz y col., 1984).

Díaz y col. (1979), mediante extracción por ácido tricloro–acético y a partir de la cepa de Brucella melitensis 115, obtuvieron un polisacárido que denominaron Poly B y que utilizado en pruebas de inmunodifusión radial era capaz de diferenciar sueros de bovinos infectados de aquellos de bovinos vacunados con Cepa 19. Blasco y col. (1984), también demostraron que este antígeno diferenciaba sueros de ovinos infectados de aquéllos vacunados con Cepa Rev 1.

Los polisacáridos obtenidos por distintos métodos han dado origen a los nombres de Poly B, hapteno nativo, hapteno ácido, etc., y aunque la estructura química de estos productos aún no está bien definida, tienen componentes comunes y un comportamiento inmunológico muy similar (Nielsen y col., 1988).

Las cualidades de estos antígenos han llevado a desarrollar diferentes técnicas para obtenerlos lo más purificados posible. Uno de los procedimientos más simples y económicos, es descrito por Díaz y col. (1981), referido a la extracción por calor, desde la cepa Brucella melitensis 1613 y luego la purificación y concentración por medio de precipitación alcohólica.

En nuestro país se han preparado y evaluado antígenos solubles obtenidos por solución salina en caliente desde la Cepa 1119–3. A pesar de no estar separados los lipopolisacáridos del polisacárido, precipitaban diferenciadamente en las pruebas de inmunodifusión (Sánchez, 1988). Con anterioridad se prepararon y evaluaron antígenos sonicados a partir de la misma cepa de Brucella, los que diferenciaron sueros de animales infectados de los vacunados (Pinochet y col., 1986).

En la preparación de los antígenos de Brucella debe considerarse su costo, simplicidad de las técnicas utilizadas, seguridad para el personal que los prepara y eficiencia en los resultados, principalmente. El propósito de este estudio es preparar y evaluar un antígeno soluble que cumpla, en lo posible, con las condiciones citadas.

Trabajo financiado por Proyecto 59/83. Fondo Nacional de Investigación Científica y Tecnológica, Chile.

 

Material y métodos

Antígeno y prueba de inmunodifusión doble

Se utilizó como semilla la cepa Brucella abortus 1119–3, facilitada por el Centro Panamericano de Zoonosis OPS/OMS, controlándose su grado de disociación (Alton y col., 1976); se cultivó en Agar Brucella (Difco M.R.), en atmósfera normal, a 37°C por 72 h. La cosecha se realizó con un tampón fosfato salino 0,07M, pH 6,4, NaCI 0,15M (PBS). La suspensión bacteriana se centrifugó a 5.000 x g durante 30 minutos, se lavó resuspendiendo el precipitado en PBS por 3 veces. La pasta bacteriana obtenida se suspendió en un volumen de PBS equivalente a 6 veces su peso y fue calentada a 120° C en un autoclave por 60 minutos. Se centrifugó a 5.000 x g para eliminar el sedimento de cuerpos bacterianos y se repitió la centrifugación esta vez a 15.000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante fue dializado contra salina tope pH 7,2 (920 ml de solución fisiológica y 80 ml de solución tope de Sórensen 0,07M) por 3 días a 4°C.

El producto obtenido fue sometido a una doble precipitación con etanol absoluto, según Díaz y col. (1981) y el precipitado resultante, fue resuspendido en agua destilada estéril, concentrándolo a 1/5 de su volumen inicial. Se mantuvo en alícuotas a –30°C hasta su uso.

Este antígeno fue titulado en sus contenidos de proteínas y hexosas mediante las pruebas de Folín y Anthrona, respectivamente (Hanson y Phillips, 1981).

La prueba de inmunodifusión doble en la que se usó este antígeno, se realizó en agarosa 0,4%, tampón fosfato salino 0,02M, pH 7,2, NaCI 0,15M ythimerosal 0,01% como preservador, utilizando una roseta de perforación con pocillos separados por 2 mm del pocillo central. Realizadas las pruebas, se mantuvieron a 26°C en cámara húmeda y la lectura se efectuó a las 24, 48 y 72 horas. Se consideró reactores, los sueros que produjeron una línea clara de precipitación.

Sueros empleados

Se conformaron 3 grupos de sueros sanguíneos:

Grupo 1. Cincuenta y cinco sueros de hembras bovinas, obtenidos en la XII Región del país (Grupo negativo).

Grupo 2. Setenta y dos sueros de hembras bovinas jóvenes vacunadas con Cepa 19 entre los 3 y 8 meses de edad. Las muestras fueron obtenidas entre 20 y 140 días postvacunación (grupo vacunado).

Grupo 3. Veintidós sueros de bovinos adultos de los cuales se aisló Brucella abortus desde glándula mamaria o desde productos de aborto. Se descartó la posibilidad de que algunas de estas cepas fuera Cepa 19. Las técnicas de aislamiento y tipificación se basaron en Alton y col. (1976) (Grupo positivo).

Se incluyó en el estudio algunos antisueros preparados en conejos, contra bacterias que presentan alguna antigenicidad cruzada con Brucella, además del antisuero de Brucella abortus 1119–3. Todos fueron preparados por inoculación seriada de organismos muertos, sin la utilización de adyuvantes.

Pruebas serológicas

Los sueros de los grupos descritos fueron sometidos a las siguientes pruebas:

Inmunodifusión doble (ID), ya citada. Seroaglutinación estándar (SAE) realizada según Alton y col. (1976), utilizando un antígeno entregado por el Centro Panamericano de Zoonosis OPS/OMS. Se utilizó la prueba rápida en placa. Rosa de bengala (RB) realizada según técnica recomendada por OPS/OMS (1982) utilizando un antígeno comercial (Bengatest M.R., IFFA Merieux, Francia). Fijación de complemento (FC) utilizando el método de microtítulo a 37°C (Alton, 1977), sólo a los Grupos 1, 2 y 3 de sueros.

Análisis estadístico

Se calculó especificidad y sensibilidad de la prueba de ID. Para las comparaciones de los resultados se utilizaron pruebas de hipótesis de independencia y de McNemar (Siegel, 1956).

Resultados

Al utilizar la prueba de ID con el antígeno en estudio, se observó la formación de una línea nítida de precipitación, frente a los sueros reactores. Los resultados se leyeron claramente a las 24 horas. Salvo en escasas oportunidades las líneas aparecieron a las 48 y 72 horas. Sólo en una oportunidad se observó, la presencia de una línea de precipitación agregada, notoriamente contaminante, que no tenía identidad con las líneas anteriormente citadas.

Los resultados de la prueba de ID estaban fuertemente asociados (p < 0,001) con los antecedentes de los sueros de los grupos 1 y 3, siendo la prueba de McNemar significativa (p < 0,05). En el cuadro 1 se puede evidenciar que la totalidad de los sueros provenientes de hembras vacunadas con Cepa 19 (grupo 2) no fueron reactores a la prueba de ID.

CUADRO 1 RESULTADO DE LA PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN DOBLE (ID) Y SU RELACIÓN CON EL ANTECEDENTE DE BRUCELOSIS DE DIFERENTES GRUPOS DE SUEROS DE BOVINOS

Grupo n Prueba  ID
negativos positivos
1 55 55 0
2 72 72 0
3 22  3 19

La sensibilidad y especificidad de la prueba de ID, basándose en los antecedentes de los sueros positivos por cultivo y negativos, fue de 86,4% y 100%, respectivamente.

En el cuadro 2 se observa que existe concordancia entre los resultados de SAE e ID en los sueros del grupo 1. Las diferencias y cambios son significativos (p < 0,001) cuando se refieren a los sueros de animales vacunados. Ninguno de los 66 sueros reactores a SAE (sospechosos y positivos) reaccionaron frente al antígeno en estudio. En el grupo 3, hubo asociación en los resultados de ambas pruebas (p < 0,05).

CUADRO 2 COMPARACIÓN DE RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE SEROAGLUTINACIÓN ESTANDAR (SAE) E INMUNODIFUSIÓN DOBLE (ID) EN SUEROS DE BOVINOS CON DIFERENTES ANTECEDENTES DE BRUCELOSIS

Grupo n Prueba SAE Prueba ID
neg. sosp. pos. neg. pos.
1 55 55 6 0 0 55 6 0 0
2 72 - 19 47 19 47 0 0
3 22 - - 22 3 19

En el cuadro 3 se observa que hay concordancia en los resultados de RB e ID para los sueros del grupo 1 y una asociación significativa (p < 0,05) entre las dos pruebas para los sueros del grupo 3. En el grupo de sueros de hembras vacunadas se repite al igual que con SAE, una diferencia significativa (p < 0,001) entre los resultados de estas pruebas, siendo los cambios también significativos.

CUADRO 3 COMPARACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE ROSA DE BENGALA (RB) E INMUNODIFUSIÓN DOBLE (ID) EN SUEROS DE BOVINOS CON DIFERENTES ANTECEDENTES DE BRUCELOSIS

Grupo n Prueba RB Prueba ID
neg. pos. neg. pos.
1 55 55 12 0 55 12 0 0
2 72 -- 60 60 0
3 22 0 22 3 19

En el cuadro 4 se observa que los resultados de la prueba de FC se comportan en forma similar a los de RB, en su relación con ID. Igualmente ninguno de los 61 sueros positivos a FC del grupo 2, dio reac ción frente al antígeno utilizado en ID. Las diferencias de los resultados de las dos pruebas fueron significativas (p < 0,001).

CUADRO 4 COMPARACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO (FC) E INMUNODIFUSIÓN DOBLE (ID) EN SUEROS DE BOVINOS CON DIFERENTES ANTECEDENTES DE BRUCELOSIS

Grupo n Prueba FC Prueba ID
neg. pos. neg. pos.
1 55 55 11 0 55 11 0 0
2 72 - 61 61 0
3 22 0 22 3 19

De los antisueros de bacterias con antigenicidad cruzada con Brucella, sólo el de Yersinia pseudotuberculosis presentó notorias diferencias de resultados entre las pruebas usadas (cuadro 5).

CUADRO 5 RESULTADO DE LAS PRUEBAS DE SEROAGLUTINACIÓN ESTANDAR (SAE) ROSA DE BENGALA (RB) E INMUNODIFUSIÓN DOBLE (ID) UTILIZANDO ANTISUEROS DE BACTERIAS QUE PRESENTAN ALGUNA ANTIGENICIDAD CRUZADA CON Brucella

Antisuero SAE RB ID
Yersinia pseudotuberculosis 1:400 + -
Proteus mirabilis 1:25 - -
Morarella bovis 1:25 - -
Staphylococcus aureus 1:25 - -
Brucella abortus 1119-3 1:400 + +

El análisis químico del antígeno en estudio, entregó los siguientes resultados: contenido de proteína, 230 μ/ml y contenido de hexosas, 127 μg/ml.

Discusión

A diferencia del método descrito por Díaz y col. (1981), en la preparación de este antígeno no se utilizó Brucella melitensis 16M, sino que Brucella abortus 1119–3, cepa muy adaptada al laboratorio desde hace años, que crece bien en medios corrientes para este género, es escasamente disociable y tiene baja virulencia. Además, los cultivos obtenidos no fueron tratados con fenol para no alterar estructuras antigénicas antes del proceso de calentamiento.

Previo a esta experiencia, se habían estudiado antígenos calentados a diferentes temperaturas, optando finalmente por orientar el estudio sólo al que fue calentado a 120°C. Este antígeno mostró una línea única de precipitación y solamente en una de las pruebas se constató una línea contaminante. Esto indicaría que el antígeno ofrecía un estado de pureza adecuado para los efectos de esta experiencia.

La prueba de inmunodifusión fue de resultado precoz y en la mayoría de los casos se pudo leer a las 24 horas, lo que la hace bastante funcional. En la realización de la prueba influyó la concentración baja de agarosa que se usó como sustrato, ya que concentraciones mayores no permitieron obtener resultados satisfactorios. Esto indicaría una poca difusibilidad del antígeno.

El método propuesto por Díaz y col. (1981) de extracción por doble precipitación alcohólica resultó práctico. El análisis del sedimento obtenido en la primera precipitación, indicó una cantidad de proteínas de 700 μ/ml y de 610 μ/ml de hexosas, generando dos líneas de precipitación en la prueba de ID, cuando fue enfrentado a sueros bovinos positivos por cultivo. Después de la segunda precipitación alcohólica, la cantidad de proteínas y hexosas resultó considerablemente menor y en los resultados de las pruebas de ID, se produjo sólo una línea de precipitación. De acuerdo a Díaz y col. (1979), se estimó que ésta correspondería a la presencia del hapteno nativo.

Las proteínas que acompañan a estos antígenos, al parecer no participan en la prueba, hecho que es corroborado por la ausencia de líneas agregadas. Esta condición también ha sido comprobada por Díaz y col. (1981). Además, se estima que las temperaturas alcanzadas en la preparación del antígeno desnaturalizarían o modificarían a éstas.

Para evaluar la eficiencia diagnóstica del antígeno en estudio, se recurrió a un esquema orientado á determinar su comportamiento frente a grupos de sueros cuyos antecedentes de brucelosis se conocían. Simultáneamente se compararon los resultados, con aquellos obtenidos por otras pruebas de diagnóstico como SAE, RB y FC. De esta manera se consideraron en mejor medida las recomendaciones de Alton y col. (1977), para evaluar una prueba de diagnóstico de brucelosis.

Debido a la poca confiabilidad de un diagnóstico bacteriológico negativo en brucelosis, se optó por recurrir a suero de bovinos de la XII Región del país, área donde nunca se ha vacunado y la enfermedad ha tenido sólo presentación esporádica. En lo predios donde se obtuvo las muestras, la brucelosis nunca se había constatado.

El grupo de sueros de vacas positivas por aislamiento del agente, lamentablemente estaba constituido por un escaso número de muestras.

Basados en los antecedentes de los sueros de los grupos 1 y 3, la especificidad de la prueba de 1D fue total y la sensibilidad alcanzó valores elevados, lo que la hacen utilizable como prueba de diagnóstico.

Las pruebas de SAE, RB y FC frente al grupo 3 de sueros, en apariencia, serían más sensibles que la prueba de ID. Frente a esta situación se podría aducir que el escaso número de muestras podría estar afectando los resultados. Además se estima que también podría deberse a problemas cuantitativos de los anticuerpos pues los tres sueros con resultado negativo a ID, presentaban los títulos más bajos de positividad a las pruebas SAE y FC, siendo los únicos con esta condición.

En relación a los antisueros usados como controles, cuando se realizó la prueba de ID frente al antisuero Brucella abortus 1119–3, la reacción no se produjo, lo que se atribuyó al hecho de haber utilizado inoculum muerto para la producción del antisuero. Al concentrar experimentalmente el antígeno la reacción de precipitación se manifestó. Esto indicaría la necesidad de conocer la concentración mínima aceptable de antígeno que debería usarse en la prueba.

Se sabe que los haptenos nativos o Poly B de Brucella son similares a los de Yersinia enterocolítica tipo 09 (Díaz y col., 1984). En esta experiencia se utilizó el antisuero Yersinia pseudotuberculosis que resultó reactor a las pruebas de SAE y RB pero no a ID. En la preparación de suero anti–Yersinia en el conejo, igualmente se utilizó un inoculum muerto, por lo que se estima que el Poly B o el hapteno nativo no indujo respuesta inmune, al no existir una infección masiva, pero sí la indujeron los antígenos del complejo lipopolisacarido. Existiría también la alternativa de que Y. pseudotuberculosis no posea el antígeno polisacárido.

El hecho de que los animales vacunados no demuestren anticuerpos en las pruebas de ID contra el hapteno nativo ha sido explicado por Díaz y col. (1979) y corroborado por Wright (1988)*, lo que según nuestras experiencias previas, obedecería además a factores cuantitativos, de los antígenos o de los anticuerpos.

El comportamiento de la prueba de ID frente a los sueros de los bovinos vacunados (grupo 2) concuerda con aquellos obtenidos por Díaz y col. (1981) utilizando Poly B.

En general se puede concluir que el antígeno en estudio, luego de ser estandarizado y probado en un número mayor de muestras, podría ser de utilidad como prueba complementaria para diferenciar respuestas a las pruebas diagnósticas, que tengan origen postvacunal, de aquellas que sean debidas a infección natural. Además, por ser un antígeno de preparación fácil y de un manejo sin complicaciones, cualquier laboratorio, con implementación elemental podría incluirlo en su rutina de diagnóstico.

__________

*

Comunicación personal: Dr. Peter F. Wright, Agriculture Canada, Animal Disease Research Institute, NEPEAN. Ontario. CANADA.

Referencias

ALTON, G.G.; L. M. JONES; D. E. PIETZ. Las técnicas de laboratorio en la brucelosis. 2a Ed. Ginebra. OPS/OMS. 1976. 175 p. Serie Monográfica N° 55.

ALTON, G.G. Standardized complement fixation test for bovine brucellosis. Aust. Vet. J. 53: 394-400, 1977.

ALTON, G.G. Development and evaluation of serological tests. In: Crawford, R., R. Hidalgo. Bovine Brucellosis: An International Symposium. Texas, USA. A. & M. University Press, 1977, pp. 61-71.

BLASCO, J.M.; R.DÍAZ; I. MORIYON; D. SALVO. Evaluation of radial immunodiffusion test for diagnosing brucellosis in sheep and its possible value for differentiating infected from Brucella melitensis, Rev. 1 vaccinated sheep. Dev. Biol. Stand. 56: 507-511, 1984.

DÍAZ, R.; L. M. JONES; D. LEONG; J. B. WILSON. Surface antigens of smooth Brucella. J. Bacteriol. 96: 893-901, 1968.

DÍAZ, R.; P. GARATEA; L. M. JONES; I. MORIYON. Radial immunodiffusion test with Brucella polysaccharide antigen for differentiating infected from vaccinated cattle. J. Clin. Microbiol. 10: 37-41, 1979.

DÍAz, R.; J. TOYOS; M.D. SALVO; M.L. PARDO. A simple method for the extraction of polysaccharide B from Brucella cells, for used in radial immunodiffusion test diagnosis of bovine brucellosis. Ann. Rech. Vét. 12: 35-39, 1981.

DÍAZ, R.; J. TOYOS; M.D. SALVO; L. FERNÁNDEZ-LAGOS; B. ALONSO; I. MORIYON; I. DORRONSORO. Studies on the polysaccharide B an native haptene of Brucella and Yersinia enterocolitica serotype 9. Dev. Biol. Stand. 56: 213-220, 1984.

DUBRAY, G. Progrés récents sur la biochimie et les propiétés biologiques des antigénes de Brucella. Dev. Biol. Stand. 56: 131-150,1984.

HANSON, R.S.; J.A. PHILLIPS. Chemical composition. In: Gerhart, P. Manual of methods for general bacteriology. American Society for Microbiology, 1981, pp. 328-364.

MC MAHON, J.J.; A. GERSTEN; J. COULL. Comparison of agargel immunodiffusion test with other seZological test for diagnosis of bovine brucellosis. North Dakota Research Report N° 78, July 1980, 7 p.

NIELSEN, K.H.; P.F. WRIGHT; W.A. KELLY; J.H. CHERWONOGRODZKY. A review of enzyme immunoassay for detection of antibody to Brucella abortus in cattle. Vet. Imm. Immunopath. 18: 331-347, 1988.

ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD / ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD (OPS/OMS). Pruebas suplementarias para el diagnóstico de la brucelosis. Centro Panamericano de Zoonosis. Bs. As. Argentina, 1982, 32 p.

PINOCHET, L.; M.L. SÁNCHEZ; P. ABALOS; D. CASTILLO; I. PALAVICINO; M.A. TOCORNAL. Diagnóstico de brucelosis bovina por prueba de inmunodifusión doble, utilizando antígenos sonicados. Av. Cs. Vet. N° Extra. SA. 067, 1986.

SÁNCHEZ, M.L. Contribución al diagnóstico de brucelosis bovina por pruebas de inmunodifusión en gel de agarosa. Tesis Magister Scientae. Fac. Cs. Vet. y Pec. Universidad de Chile, 1988, 76 p.

SHURING, G.G.; L.M. IONES; S.L. SPETH; D.T. Bergman Antibody response to antigens distinct from smooth lipopolysaccharides complex in Brucella infection. Infect. Immun. 21: 994-1002, 1978.

SIEGEL, S. Nonparametric statistics for behavioral sciences. New York. McGrav-Hill Book, 1956, 313 p.

TABATABAI, L. B.; B.C. DEYOE. Characterization for salt extractable protein antigens from Brucella abortus by crossed immunoelectroforesis and isoelectrofocusing. Vet. Microbiol. 9: 549-560, 1984.

Recibido el 8 de mayo de 1989.